蝴蝶兰组织培养快繁技术的研究.doc

分类号 单位代码 密 级 学 号 本科毕业论文题 目蝴蝶兰组织培养快繁技术的研究作 者 院 (系)生命科学学院专 业植物科学与技术指导教师 答辩日期 2013 年 月 日榆 林 学 院本科毕业论文诚信责任书本人郑重声明：所呈交的毕业论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的成果。毕业论文中凡引用他人已经发表或未发表的成果、数据、观点等，均已明确注明出处。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经公开发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人毕业论文与资料若有不实，愿意承担一切相关的法律责任。 论文作者签名: 年 月 日摘 要摘 要本课题以蝴蝶兰组培苗为原料，用花梗节间做外植体。通过对休眠芽的诱导，对原球茎状体的诱导、增殖、分化、生根等试验，集中研究不同培养基类型、不同激素配比和用量的选择、不同添加物的选择等多个方面因素对蝴蝶兰组培快繁的影响，根据试验及数据分析筛选出适宜的培养基配方，以期优化蝴蝶兰组织培养快繁技术，建立蝴蝶兰组培植株再生技术体系。结果表明，在本试验设计范围内，最适宜原球茎诱导的培养基为：MS+2mg/L 6-BA+0.2mg/L 2,4-D；最适宜原球茎的增殖、分化的基本培养基为：1/3MS；最适宜原球茎状体进行生根的基本培养基及添加物为1/3MS+30g/L香蕉汁。关键词：蝴蝶兰，组织培养，原球茎，培养基Study on the Technique of Tissue Culture and Rapid propagation of PhalaenopsisABSTRACTThis study use Phalaenopsis plantlets as material, and use the internode sections as explants. Through the induction of dormancy buds, and a series of experiments on protocorm-like bodies, including induction, proliferation, differentiation and rooting, the aim is to focus on the influence of different media types, different hormone proportion and dosage selection, and the choice of different additives on tissue culture and rapid propagation of Phalaenopsis. According to the experiment and the analysis of the data, find out the suitable medium composing, in order to optimize the technology of the plant tissue culture of Phalaenopsis, at the same time, establish the technical system of Phalaenopsis tissue culture. The results show that, in the range of this experimental design, the suitable medium for inducing protocorm-like bodies is MS+2mg/L 6-BA+0.2mg/L 2,4-D; the best basic medium for proliferating and differentiating protocorm-like bodies is 1/3MS, and the optimized basic medium and addition for rooting is 1/3MS+30g/L banana juice.Key words: Phalaenopsis; Tissue culture; Protocorm-like bodies (PLB); Medium目 录目 录摘 要ABSTRACT目 录第1章 绪论11.1 蝴蝶兰的形态特征及生长习性11.2 蝴蝶兰的经济价值11.3 选题的理论意义和实际价值2第2章 材料与方法32.1 材料32.2 方法32.2.1培养基的配制及灭菌32.2.2外植体的选择及消毒42.2.3休眠芽的诱导42.2.4原球茎的诱导42.2.5原球茎的增殖52.2.6生根培养5第3章 结果与分析63.1 不同激素配比对原球茎形成的影响63.2 不同基础培养基对原球茎增殖的影响63.3 不同类型培养基和不同添加物对生根的影响7第4章 结论与讨论104.1 结论104.2 讨论10参考文献12致 谢13 榆林学院本科毕业设计（论文）第1章 绪论1.1 蝴蝶兰的形态特征及生长习性蝴蝶兰为单子叶植物纲、兰科、多年生常绿草本。株高50-80cm。根簇生，肉质，圆柱形，根性为缠绕性，具气生根，十分发达。蝴蝶兰是属于单茎类的兰科植物，茎基部肥厚，茎短，长约2-3cm；单叶、叶基生、对生，带状，肥大，革质，先端钝圆，全缘，革质亮绿，叶大，常排成2列，广椭圆形，长20-26cm，宽8-10cm，叶鞘成管状抱茎1；花两性，两侧对称，花瓣直径约6cm，花朵直径约10cm。花被片6片，两轮，外轮3片为萼片，内轮三片，两侧称花瓣，中间称“唇瓣”2,“唇瓣”是蝴蝶兰很好的特征，大部分的蝴蝶兰唇瓣会分裂成两条触角般的短须，使其更神似蝴蝶。蝴蝶兰的花色丰富，有纯白、粉红、紫红、黄、绿、黄色带赤斑纹、白色红唇、白底红条纹等，不胜枚举3。蝴蝶兰原产亚洲热带地区。多野生于热带阴湿多雾的热带森林中离地3-5m的树干上，也有长于溪涧旁的湿石上，喜高温，高湿，半阴而通风的环境，生长适温为白天25-28，夜间18-20。越冬温度不低于18，10以下就会停止生长，低于5容易死亡。1.2 蝴蝶兰的经济价值花卉产业是当今世界最具活力的产业之一, 花卉产业的发展可以提高人们生活质量，改善城市投资环境和人居环境，促进相关产业及第三产业的迅速发展，对新时期农业产业结构的调整、保护人类生态环境和人类身心健康、有效地提高社会效益和生态效益都具有相当巨大的作用。花卉作为高附加值产品，它的经济效益远远高于其它农产品，其收益率达4272，投资利润率175，投资回收期4年，因此，可以断定，花卉业将成为本世纪迅猛发展产业之一4。蝴蝶兰的观赏价值和经济价值都很高，在世界花卉产业中的地位很高，甚至在近些年的市场上已有逐渐取代其它花卉的趋势，除种植市场外，其在切花、盆花，以及国内逐渐流行起来的新娘捧花市场中均呈欣欣向荣之景况，市场需求量逐年增加，甚至现出供不应求之势。蝴蝶兰较其他花卉具有花期长、耐贮运、宜于室内摆设、投资回报率高等优点，因而成为花卉业的新宠。据Floraculture Internationa1统计，早在2002年，全球兰花贸易总额就已经超过1.5亿美元，其中以蝴蝶兰为主。我国目前兰花生产厂家1000多家，近20年来，云南、福建、广东等地区都建立了商品化育苗繁殖基地，并且收益颇丰，随着园艺设施的日趋完善，温室在全国各地得到推广建设，一些北方省市也建立了较大规模的蝴蝶兰繁育温室。我国台湾蝴蝶兰种苗产业年产值约25亿新台币，瓶苗产量达9000万株，种苗4000万株。国际上，在美国、日本、韩国等国家，蝴蝶兰在盆花消费中排行第一，在荷兰排行第二4，由此可见，蝴蝶兰商场广阔，潜力巨大。1.3 选题的理论意义和实际价值随着人们生活水平的提高，花卉产业逐渐兴起，兰花的需求量与日俱增，其中，由于蝴蝶兰花型独特、姿态优雅、色彩鲜艳、花期长久素有“兰花皇后”的美誉，观赏价值极高，深受世人喜爱5。但由于蝴蝶兰是单茎性气生兰， 植株很少发育侧枝，很难采用常规分株方式进行无性繁殖。 其种子也不含胚乳或其他组织， 在自然条件下萌发率极低， 因此无法利用播种方式进行有性繁殖。而采用组织培养方法进行种苗繁殖是目前蝴蝶兰大规模生产的唯一途径6，而且应用组织培养技术进行蝴蝶兰快速繁殖可以缩短繁育期，获得大量成株，并且可以保持优良性状，维护种质资源，目前，蝴蝶兰快繁途径主要是利用各种外植体诱导原球茎，进而诱导分生苗实现快繁7。自RotorG1949年利用蝴蝶兰花梗腋芽培养出试管苗以来，蝴蝶兰组培种苗的工厂化生产迅速发展，技术日趋成熟，但目前由于专业性培育蝴蝶兰的整体水平不是很高，关键的生产环节技术薄弱，造成蝴蝶兰生产成本较高，繁殖系数偏低，工业化生产效率不高，因此建立和完善蝴蝶兰组培快繁技术是解决这一问题的关键环节8。本课题通过对蝴蝶兰组培所应用培养基的研究，选取不同培养基类型、不同激素配比和用量、不同添加物等多个方面问题，通过试验及数据分析筛选出适宜的培养基配方，以期优化蝴蝶兰组织培养快繁技术，建立蝴蝶兰组培植株再生技术体系。第2章 材料与方法2.1 材料供试蝴蝶兰为榆林学院植物组织培养试验室蝴蝶兰试苗；供试药剂为0.1%的升汞、MS培养基所需药品、6BA、NAA、2,4-D、香蕉汁、苹果汁、土豆汁等。2.2 方法2.2.1 培养基的配制及灭菌休眠芽的诱导培养基的配制 根据张启香等9研究得知，基础培养基用MS培养基为宜，其中NH4NO3 1650mg/L，KNO3 1900mg/L，KH2PO4 170mg/L，MgSO47H2O 370mg/L，CaCl22H2O 440mg/L，MnSO44H2O 22.3mg/L，ZnSO47H2O 8.6mg/L，H3BO3 6.2mg/L，KI 0.83mg/L，Na2MoO42H2O 0.25mg/L，CuSO45H2O 0.025mg/L，CoCl26H2O 0.025mg/L，Na2EDTA 37.25mg/L，FeSO47H2O 27.85mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，维生素B1 0.4mg/L，维生素B6 0.5mg/L，烟酸 0.5mg/L，肌醇 100mg/L，蔗糖30g/L，琼脂 8g/L10。又根据吕晓辉等11的研究得知添加5.0 mg/L BA+0.5 mg/L NAA较适合休眠芽的诱导。用柠檬酸调节PH至5.4。为预防褐化，配制母液时每升内加15g活性炭。原球茎的诱导培养基的配制 首先，配制MS培养基，为了解不同浓度的BA 和NAA组合对蝴蝶兰原球茎诱导率的影响，分别加入6-BA、2，4-D，6-BA设置三个水平：1mg/L、2mg/L、3mg/L；2,4-D设置四个水平：0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L。每种处理配制5瓶，共60瓶。原球茎的增殖培养基的配制 为了解不同基本培养基对原球茎增殖的影响，分别配制MS培养基5瓶，各药品含量减半的1/2MS培养基5瓶，药品含量减为1/3的1/3MS培养基5瓶，共15瓶。根据王静等12的研究2.0mg/L的6-BA和0.3mg/L的NAA配合使用原球茎的增殖分化效果最好，所以本试验培养基中添加的生长调节物质均为2.0mg/L的6-BA和0.3mg/L的NAA。梁宏伟等13指出，添加活性炭对于原球茎和幼苗生长也具有积极作用，防止培养材料出现褐化。因此，在母液配制时添加20g/L活性炭。生根培养基的配制 为探究不同培养基和添加物对蝴蝶兰原球茎生根的影响，设置MS+30g/L香蕉汁、MS+30g/L苹果汁、MS+30g/L土豆汁、1/2MS+30g/L香蕉汁、1/2MS+30g/L苹果汁、1/2MS+30g/L土豆汁、1/3MS+30g/L香蕉汁、1/3MS+30g/L苹果汁、1/3MS+30g/L土豆汁9组，每组配制10瓶，共90瓶。培养基的灭菌 分装好的培养基用高压蒸汽灭菌锅进行灭菌，在121时保持25min即可。2.2.2 外植体的选择及消毒根据细胞全能性理论，植物的任何组织器官均可作为离体培养的外植体，但不同组织的形态发生能力不同，甚至不同发育程度的相同组织也会影响离体培养的效果。因此在培养时，应选择合适的外植体。顾伟民等14研究结果表明，采用花梗侧芽做外植体，成活率较其他组织要高，达75%，其次为花梗，成活率为62.5%。本次试验采用的外植体为花梗节间，具体取材方法为：取饱满休眠芽花梗节之间1-2cm长的幼嫩部分，切取长2-3mm的切段15。将切段用蒸馏水清洗干净，在超净工作台上先用70%的酒精浸泡25s左右，然后用无菌水清洗3-5次，再用0.1%升汞浸泡5-8min，取出后用无菌水清洗3-5次，去除休眠芽外苞叶，待接种。2.2.3 休眠芽的诱导在超净工作台上，用酒精灯灼烧接种针20s，自然冷却后，用接种针将切段基部向下接种到培养基上，每瓶接种10段。接种后，在温度252，光照强度1500-2000lx，光照时数10h/d的条件下培养，培养约三个月时间。定期观察记录休眠芽生成情况。此培养过程时间较长,且不在本课题研究范围内,所以实验所用材料为提前诱导出的休眠芽。2.2.4 原球茎的诱导在蝴蝶兰组培研究中，原球茎的诱导是在基础培养基内添加一定种类及浓度的植物生长调节剂由幼叶、根尖、茎尖等外植体脱分化而产生胚性愈伤组织，进而形成原球茎体16。本试验采用根尖做原球茎的诱导原材料。在超净工作台上，用酒精灯灼烧解剖刀20s，待自然冷却后，在诱导生成的休眠芽中切取根尖部位约1cm，然后用自来水清洗25min，再用70%酒精灭菌30s，0.1%升汞溶液灭菌10min，无菌水清洗3-5次，根据杨海燕17的研究，用消毒过的刀片在根尖顶端纵向切割两刀成十字型，能有效增加诱导率，切割后分别插入不同培养基中进行原球茎诱导培养，每瓶培养基中放置3个根尖。培养条件为温度252，光照强度2000lx，光照时数12h/d。定期观察记录原球茎诱导情况，分别记录数据，统计各培养基中的诱导率。2.2.5 原球茎的增殖在蝴蝶兰的组培快繁研究中，影响原球茎增殖的因素较为复杂，主要有试验中所使用的蝴蝶兰品种、原球茎切割体积、外植体的选择、培养的环境条件以及增殖培养基的选择等18。本试验主要研究增殖培养基对原球茎增殖分化的影响。在原球茎状体形成后，在超净工作台上取出，用经过酒精灯20s灼烧，并自然冷却后的解剖刀切成4mm*4mm左右小块，然后放入生根培养基中，每瓶培养基内放5小块，将接种好的培养基在温度25左右，光强1500-2000lx，光照时数为10h/d的条件下培养。定期观察统计增殖株数，统计各培养基的增殖系数。2.2.6 生根培养当芽长至2cm左右高，并长出2-3片叶子时，可转移至试验设计好的生根培养基中进行生根培养。超净工作台上，用经过酒精灯灼烧20s并自然冷却后的镊子将芽体取出，并转移至生根培养基中培养，每瓶中移栽1-2株即可，然后将培养基在温度25-28，光强2000-3000lx，光照时数为12h/d的条件下培养。定期观察茎基部变化，记录生根情况，统计各培养基的生根率。第3章 结果与分析3.1 不同激素配比对原球茎形成的影响试验结果数据统计见表3-1，由表3-1可知，不同的6-BA、2,4-D配比对蝴蝶兰原球茎的诱导效果不同。在各种处理中，用2mg/L 6-BA+0.2mg/L 2,4-D处理的5瓶，15个根尖，经过15天的培养后，污染3个，8个萌芽，按公式3-1计算，得萌芽率为66.7%，在各个处理组别中最高。萌芽率=萌芽外植体数/（接种外植体数-污染外植体数）100% 公式3-1表3-1 不同浓度的6-BA 和2,4-D组合对蝴蝶兰原球茎萌芽的影响6-BA（mg/L）萌芽率（%）0.2mg/L 2,4-D0.3mg/L 2,4-D0.4mg/L 2,4-D0.5mg/L 2,4-D144.337.232.734.7266.746.642.326.1345.059.340.339.23.2 不同基础培养基对原球茎增殖的影响 试验结果及数据统计见表3-2，由表3-2可知，不同基础培养基对蝴蝶兰原球茎增殖的影响效果不同。其中，由1/3MS培养基培养的原球茎（5瓶，每瓶5株，共25株）经过20天培养后，增殖达52株。按照公式3-2计算得知用1/3MS培养基培养的原球茎增值系数高达1.08，而1/2MS培养基培养的原球茎增值系数为0.56，MS培养基培养的原球茎增值系数仅为0.36。通过每隔5天对株高的测量数据所绘得的各组平均株高柱状分布图（图3-1）得知，1/3MS培养基内植株的平均株高一直高于其他两组，到20天时平均株高达到2cm，已经适合生根培养。增值系数=增殖株数/接种株数 公式3-2表3-2 不同基础培养基对蝴蝶兰原球茎增殖的影响MS接种株数增殖株数增值系数1/325271.081/225140.5612590.36图3-1 不同培养基下培养蝴蝶兰原球茎增殖后平均株高柱状分布图3.3 不同类型培养基和不同添加物对生根的影响试验结果及数据统计见表3-3，由表3-3可知，在添加物的选择上，30g/L的香蕉汁的生根效果最好，在基础培养基的选择上1/3MS培养基的生根效果最好。试验共9组处理，每组处理中接种10-20株不等，1/3MS+30g/L香蕉汁的处理共接种16株，正常生根15株，按公式3-3计算，得生根率达到93.8%。生根率=生根株数/接种株数100% 公式3-3表3-3 不同培养基和相同浓度不同添加物对蝴蝶兰原球茎生根的影响MS生根率Rate of roofing（%）30g/L 香蕉汁30g/L 苹果汁30g/L 土豆汁178.566.569.21/286.572.978.01/393.883.480.9通过每隔5天对各组处理的观察与测量，得到各组平均根长的生长折线图，由图3-3-1可知，在1/3MS培养基内添加香蕉汁的生根效果明显优于添加苹果汁、土豆汁的处理，到第20天时，添加香蕉汁培养基内的平均根长达到4.7cm。由图3-3-2可知，在1/2MS培养基内添加香蕉汁的生根效果也明显优于添加苹果汁、土豆汁的处理，20天后测量平均根长为4.3cm。由图3-3-3可知，在MS培养基中添加香蕉汁的生根效果也明显于添加苹果汁、土豆汁的处理，20天后，平均根长为4cm。图3-3-1 1/3MS基础培养基内添加不同物质后20天内的平均生根长度折线图图3-3-2 1/2MS基础培养基内添加不同物质后20天内的平均生根长度折线图图3-3-3 MS基础培养基内添加不同物质后20天内的平均生根长度折线图第4章 结论与讨论4.1 结论综合上述通过对休眠芽的诱导，对原球茎状体的诱导、增殖、分化、生根等试验，特别是通过对原球茎诱导适宜6-BA、2,4-D配比、适宜原球茎增殖的基础培养基、适宜原球茎生根的基础培养基及添加物的研究，得出以下结论：1.由花梗节间外植体诱导出的休眠芽在生长调节物质用量为2mg/L 6-BA+0.2mg/L 2，4-D时较适宜，诱导的外植体萌芽率达到66.7%，其他水平萌芽情况较差，其中2mg/L 6-BA+0.5mg/L 2,4-D的处理，萌芽率仅为26.1；2.原球茎的增殖培养基在生长调节物质按2.0mg/L6-BA+0.3mg/L NAA添加的基础上，通过对比不同MS用量原球茎的增殖情况得出1/3MS较为适宜，增值系数达1.08，而用MS的增值效果最差，增值系数仅为0.36。培养20天后测量平均株高，1/3MS培养基下增殖株的平均株高达1.8cm高于其他两组；3.适宜生根的基础培养基及添加物的组合为1/3MS+30g/L香蕉汁。生根率达89.3%，控制单一变量得出香蕉汁的诱导效果好于苹果汁和土豆汁，1/3MS的培养效果好于1/2MS和MS。4.2 讨论由于影响蝴蝶兰组培快繁的因素很多，如蝴蝶兰品种的选择、外植体的选择、外植体的消毒处理方法、基础培养基的选择、生长调节物质的选择及添加量、培养温光条件等，该试验是在参考许多学者先前的试验数据的基础上完成的，因取材、时间等因素的限制主要研究了诱导原球茎发生、增殖、生根三个部分，且没有控制全部可变量，最后的试管苗的移栽环节也未完成。许多数据的可行性还有待进一步试验的确定。在诱导原球茎发生过程，本实验采用的是蝴蝶兰休眠芽的根尖，利用根尖诱导原球茎优点是剪取根尖对母体影响小，外植体多，取材不受季节限值，缺点是诱导率低，且容易褐化死亡，在选择植物生长调节物质时选择2,4-D，而NAA对诱导根尖无明显效果，这有效缓解了诱导率低的问题，活性炭的加入缓解了培养过程的褐变问题。在原球茎的增殖过程中,尽量将接入培养基的原球茎密度减低，因为试验发现过于密植导致增值缓慢，但由于此试验并未对移植密度对增殖的影响做数据统计及对比，所以适宜的密度仍需进一步试验研究。在生根培养过程中，参考文献多处提到添加椰汁的生根效果较好，由于成本问题，本试验没有完成椰汁添加的试验，仅对比了香蕉汁、苹果汁、土豆汁的培养效果，所得数据是否能有力支持蝴蝶兰大规模商业培养还有待进一步研究。近年来，随着蝴蝶兰生产量的逐渐增大,已经不再是名贵品种,市场上的销量也趋于平缓,甚至有下降趋势。所以,国内蝴蝶兰快速繁殖的研究更应该加紧完善现有的技术体系，降低组培成本，以提高经济效益。11参考文献参考文献1 陈俊愉,程绪珂.中国花经M.上海文化出版社,1990:626-627.2 谷祝平,杨兰一.艳丽神奇的世界M.四川科学出版社,1991.3 谢峰.蝴蝶兰的组织培养研究D.广西大学，2004.6.4 卜朝阳,李炳橘.蝴蝶兰组培快繁商品化生产经济效应分析J.华中农业大学学报,2007(67). 5 郑玉忠,张振霞,陈泽华.蝴蝶兰组织培养研究进展（综述）J.亚热带植物科学,200