分子生物学实验报告.doc

分子生物学实验分子生物学实验 院系 院系 生命科学与技术学院生命科学与技术学院 专业 专业 生物科学 基地 生物科学 基地 班级 班级 201101201101 班班 学号 学号 姓名 姓名 分子生物学基础实验分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺 少的一部分 为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力 生物技术综合实验室主要开 设常用而基本的分子生物学实验技术 它的内容包括质粒 DNA 的制备 DNA 的重组 PCR 基因扩增等等 实验一实验一 质粒质粒 DNADNA 的小量制备的小量制备 一 实验原理一 实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段 送进细胞中去进行繁殖和表达 需要运 载工具 携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体 vector 载体的设计和应用 是 DNA 体外重组的重要条件 作为基因工程的载体必须具备下列条件 1 是一个复制子 载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖 2 载体在受体细胞中能大量增殖 只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增 3 载体 DNA 链上有 1 到几个 限制性内切酶的单一识别与切割位点 便于外源基因的插入 4 载体具有选择性的遗 传标记 如有抗四环素基因 Tcr 抗新霉素基因 Ner 等 以此知道它是否已进入受 体细胞 也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来 细菌质粒具备上述条 件 它是基因工程中常用的载体之一 质粒 plasmid 是一种染色体外的稳定遗传因子 大小在 1 120kb 之间 具有双 链闭合环状结构的 DNA 分子 主要发现于细菌 放线菌和真菌细胞中 质粒具有自主复 制和转录能力 能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数 可表达它携带的遗传信息 它可独 立游离在细胞质内 也可以整合到细菌染色体中 它离开宿主的细胞就不能存活 而它控 制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿 质粒在细胞内的复制 一般分为两种类型 严密控制型 stringent control 和松弛 控制型 relaxed control 前者只在细胞周期的一定阶段进行复制 染色体不复制时 它也不复制 每个细胞内只含有 1 个或几个质粒分子 后者的质粒在整个细胞周期中随时 复制 在细胞里 它有许多拷贝 一般在 20 个以上 通常大的质粒如 F 因子等 拷贝数 较少 复制受到严格控制 小的质粒 如 ColE 质粒 含有产生大肠杆菌素 E1 基因 拷贝数较多 复制不受严格控制 在使用蛋白质合成抑制剂 氯霉素时 染色体 DNA 复 制受阻 而松弛型 ColE 质粒继续复制 12 16h 由原来 20 多个拷贝可扩增至 1000 3000 个拷贝 此时质粒 DNA 占总 DNA 的含量由原来的 2 增加到 40 50 本实验分离提纯化的质粒 pBR322 pUC19 就是由 ColE 衍生的质粒 所有分离质粒 DNA 的方法都包括三个基本步骤 培养细菌使质粒扩增 收集和裂解细 菌 分离和纯化质粒 DNA 采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁 十二烷基硫酸钠 SDS 可使 细胞壁解 经溶菌酶和阴离子去污剂 SDS 处理后 细菌染色体 DNA 缠绕附着在细胞 壁碎片上 离心时易被沉淀出来 而质粒 DNA 则留在清液中 用乙醇沉淀 洗涤 可得 到质粒 DNA 质粒 DNA 的相对分子量一般在 106 107范围内 如质粒 pBR322 的相对分子质量为 2 8 106 质粒 pUC19 的相对分子质量为 1 7 106 在细胞内 共价闭环 DNA covalently closed circular DNA 简称 cccDNA 常以超螺旋形式存在 如果 两条链中有一条链发生一处或多处断裂 分子就能旋转而消除链的张力 这种松弛型的分 子叫做开环 DNA open circular DNA 简称 ocDNA 在电泳时 同一质粒如以 cccDNA 形式存在 它比其开环和线状 DNA 的泳动速度快 因此在本实验中 自制质粒 DNA 在电泳凝胶中呈现 3 条区带 二 实验目的二 实验目的 1 掌握最常用的提取质粒 DNA 的方法和检测方法 2 了解制备原理及各种试剂的作用 三 实验材料和试剂三 实验材料和试剂 材料 大肠杆菌E coli 含 pBR322 质粒 试剂 1 LB 培养基 10g L 胰蛋白胨 5g L 酵母提取物 10g L NaCl 用 NaOH 调 pH 至 7 3 左右 如固体培养基则添加 15g L 琼脂 2 溶液 pH8 0G E T 缓冲液 50 mmol L 葡萄糖 25mmol LTris HCl 10mmol L EDTA 灭菌后存放 3 溶液 0 2mol LNaOH 内含 1 SDS 预先配制 1 SDS 母液 临用前一天晚上 加入 0 2mol LNaOH 4 保存 4 溶液 pH4 8 乙酸钾溶液 5mol L 乙酸钾 60mL 冰乙酸 11 5mL 双蒸馏水 28 5mL 5 酚 氯仿液 V V 1 1 酚为重蒸酚 配制时 先将氯仿中加入异戊醇 使其体积比为 24 1 然后等量的加入重蒸酚 混匀 并用 0 1mol LTris HCl pH7 6 抽提几次以平衡 这一混合物 于棕色瓶中存放 并在上面覆盖等体积的 0 01 mol LTris HCl pH7 6 4 保存 6 无水乙醇 7 70 乙醇 8 pH8 0 TE 缓冲液 10mmol LTris HCl 1mmol LEDTA 其中含 RNA 酶 20 g mL 仪器 恒温培养箱 恒温摇床 超净工作台 高压蒸汽灭菌锅 台式高速离心机 台式小型 振荡器 EP 管 1 5mL 微量离心管 加样器 20uL lmL 吸头 四 操作步骤四 操作步骤 一 培养细菌 将带有质粒 pBR322 的大肠杆菌接种在含 50 g mL 氨苄青霉素 Amp 的 LB 液体培 养基中 37 振荡培养过夜 注意 添加 Amp 时 须待 LB 培养基冷却到 50 左右方可 加入 二 从菌落中快速提取制备质粒 DNA 1 取 1 4mL 菌液置于 1 5mL Ep 管中 7500rpm 离心 1min 2 弃上清 加入 150 L GET 缓冲液 在涡旋混合器上充分混匀 在室温下放置 10min 3 加入 200 L 新配制的 0 2mol L NaOH 内含 1 SDS 加盖 颠倒 不要振荡 2 3 次 使之混匀 冰上放置 4min 最多不能超过 5min 4 加入 150 L 冰冷的乙酸钾溶液 加盖后 颠倒数次使之混匀 冰上放置 15min 5 10000rpm 离心 5min 上清液吸至另一干净的 1 5mL Ep 中 如上清液浑浊则需重新 离心一次 6 于上清液中加等体积酚 氯仿液 振荡混匀 12000rpm 离心 2min 小心吸取上清液 转移至另一 1 5mL Ep 管中 注意勿将两液相中间的白色蛋白薄层吸出 7 向上清液加入 2 倍体积无水乙醇 混匀 室温放置 min 用离心机于 10000rpm 离 心 5min 倒去上清液 8 用 0 5mL 70 乙醇洗涤沉淀一次 10000rpm 离心 3min 除尽乙醇 室温自然干燥 将离心管倒置于一张纸巾上 备用 9 用 30uL 含无 DNA 酶的胰 RNase 20 ug mL 的 TE 重新溶解 DNA 置于 4 保存 供下午电泳使用 这里因为要检测质粒是否提取成功以及提取质粒的浓度 故在此要进行一次电泳 下 面为琼脂糖凝胶电泳的原理及方法 原理 原理 根据 DNA 分子量不同 采用外加电场使其分开 用 EB 嵌入 DNA 分子后在紫外下 显荧光 而荧光强度正比于 DNA 的含量 如将已知浓度的标准样品表 2 1 作为电泳对 照 就可以估计出待测样品的浓度 电泳后的琼脂凝胶糖直接在紫外灯下拍照 只需要 5 10ngDNA 就可以从照片上比较鉴别 由于电泳时所用的样品量非常少 只要将浓度控制在几十纳克即可 所以在基因工程 中经常被用做检测 DNA 样品 表 2 1 DNA Hind 中 DNA 片断 总 DNA 含量为 100 琼脂糖凝胶板的制备琼脂糖凝胶板的制备 1 琼脂糖凝胶的制备 称取 1 0g 琼脂糖 置于锥形瓶中 加入 100mL TBE 缓冲液 于电炉上加热 注意 防止溢出 由于琼脂糖较难溶解 如果水分损失较大 则补充一定量的蒸馏水 使其终浓 度为 1 2 胶板的制备 将有机玻璃内槽洗净 晾干 取胶带纸将有机玻璃内槽的两端边缘封好 形成一个边 脚模子 注意 将橡皮膏紧贴在有机玻璃内槽两端边上 不能留空隙 将有机玻璃内槽置于水平位置 放好样品槽模板 一般称之为梳子 将冷却至 65 左 右的琼脂糖凝胶 小心地倒在内槽上 控制灌胶速度 使胶液缓慢地展开 直到整个有机 玻璃板表面形成均匀的胶层 室温下静置 1h 左右 待凝固完全后 轻轻拔出样品槽模板 片段碱基对数目 kb相对分子质量DNA 含量 DNA 含量 ng mg 123 13015 0 10647 7476 9 29 4196 12 10619 4194 1 36 5574 26 10613 5135 2 44 3712 84 106989 9 52 3221 51 1064 847 9 62 0281 32 1064 241 8 70 5640 37 1061 111 6 80 1250 08 1060 32 6 撕去胶带纸 胶板上即形成相互隔开的样品槽 将有机玻璃内槽放入电泳槽中 加入 0 5 TBE 电泳缓冲液 以盖过胶板为宜 胶板内的样品小槽 3 加样 用移液枪将上述样品分别加入胶板的样品小槽内 每次加完一个样品为了避免交叉污 染 各样品用不同的枪头 以免造成限制酶被污染 加样时 枪头不要插入胶板内 防止 碰坏样品槽周围的凝胶面 每个样品槽的加样量不宜过多 本实验加样为 10uL 左右 每 块胶板需点一个 Marker 这里即为 DNA Hind 4 电泳 加完样品后应立即通电 进行恒压电泳 在低压条件下 线形 DNA 片段的迁移速度 与电压成比例关系 为了获得电泳分离 DNA 片段的最大分辨率 电场强度不应高于 5V cm 当溴酚蓝染料 蓝色 移动到距离胶板下沿约 1 2cm 处 停止电泳 5 染色 将电泳后的凝胶浸入 EB 染液中 进行染色以观察在琼脂糖凝胶中的 DNA 带 染色 20min 后 用大量水冲洗 6 观察 在波长为 254nm 的紫外灯下 观察染色后的电泳凝胶 DNA 存在处显示出红色荧光 条带 用凝胶自动成像仪处理代替 五 注意事项五 注意事项 1 收集菌体提质粒前 培养基要去除干净 同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮 2 在添加溶液 与溶液 后溶液的混合一定要柔和 采用上下颠倒的方法 千万不能在 旋转器上剧烈振荡 其中加入溶液 后 溶液变成澄清 并有黏性 加入溶液 后 出现絮状沉淀 3 苯酚具有腐蚀性 能造成皮肤的严重烧伤及衣物损坏 使用时应注意 如不小心皮肤 上碰到苯酚则应用碱性溶液 肥皂及大量的清水冲洗 4 苯酚可以用于抽提纯化 DNA 由于苯酚的氧化产物可以使核酸链发生断裂 所使用的 苯酚在使用前必须经过重蒸 且都必须用 0 1mol LTris HCl pH7 6 进行平衡 所以取 酚 氯仿 异戊醇时应取下层溶液 因为上层是 Tris HCl 液隔绝空气层 5 酚 氯仿 异戊醇抽提时 应充分混匀 经酚 氯仿 异戊醇抽提后 吸取上清液时注意 不要把中间的白色层吸入 其中含有蛋白质等杂质 6 实验中 涉及酚 氯仿溶液的操作要格外小心 而且与之接触的吸头 Ep 管 全部弃 用 不回收 7 有些质粒本身可能在某些菌种中稳定存在 但经过多次移接有可能造成质粒丢失 因 此不要频繁转接 每次接种时应挑单菌落 6 6 实验结果与分析实验结果与分析 提取质粒 DNA 后 经琼脂糖凝胶电泳 图谱如下 图中 M 为 Marker 4 号为本人所提取的质粒 DNA 凝胶电泳的检测图 本人所用的质粒为 pEGFP N3 由跑胶结果可知 质粒 DNA 分子 条带较为明亮 说明所提取的 DNA 浓度很高 前面原理部分提到 质粒 DNA 分子的结构多样 包括超螺旋结构 开环结构以及线性结构等 它 们在凝胶中的泳动速度不同 所以在图谱中显示 有多条带 胶孔中比较亮的部分表明提取的质粒 中有大量蛋白质残留 条带非常宽而且两侧有轻 微的拖尾迹象表明点样时样品量加的过多 在质 粒检测中可以适当减少加样量 使得条带清晰均 匀一点 一般在实验室中 不会单独检测质粒 DNA 或者检测质粒 DNA 时不用 Marker 这 主要是因为质粒 DNA 分子结构多样 在电泳图 谱中并不能够正确显示其大小 七 思考题七 思考题 1 1 裂解细菌时需注意的事项有哪些 裂解细菌时需注意的事项有哪些 答 首先注意的是 SDS NaOH 处理的时间 质粒制备过程中 如果质粒长时间暴露于 NaOH 质粒有可能不可逆变性 使得抽提质粒中有部分是变性质粒 这些变性质粒 不 能酶切 所有一般情况下 SDS KOH 处理时间不能超过 5 分钟 最好在冰里处理 观察 到液体变得清就可以加入中和液 其次是在添加溶液 与溶液 后溶液的混合一定要柔和 采用上下颠倒的方法 千万不能在旋转器上剧烈振荡 否则会是质粒 DNA 断裂 影响提 取的效果与浓度 2 2 质粒的基本性质有哪些 质粒的基本性质有哪些 答 质粒是一种染色体外的稳定遗传因子 是双链闭合环状结构的 DNA 分子 具有自主 复制和转录能力 可独立游离在细胞质内 也可以整合到细菌染色体中 3 3 碱裂解法提取质粒碱裂解法提取质粒 DNADNA 中各溶液的作用是什么 中各溶液的作用是什么 答 溶液 溶液 pH8 0 pH8 0 GETGET 缓冲液缓冲液 葡萄糖的作用是使悬浮后的大肠杆菌不会很快沉积到管 EP 的底部 增加溶液的粘度 维持渗透压及防止 DNA 受机械剪切力作用而降解 EDTA 是 Ca2 和 Mg2 等二价金属离子的螯合剂 在溶液 I 中加入 EDTA 是要把大肠杆菌细 胞中的二价金属离子都螯合掉 从而起到抑制 DNase 对 DNA 的降解和抑制微生物生长 的作用 溶液溶液 0 2mol LNaOH 0 2mol LNaOH 内含内含 1 1 的的 SDS SDS NaOH 是最佳溶解细胞的试剂 不管是大肠 杆菌还是哺乳动物细胞 碰到了碱都会在瞬间溶解 这是由于细胞膜发生了从 bilayer 双层膜 结构向 micelle 微囊 结构的相变化 SDS 是离子型表面活性剂 它 主要作用是 a 溶解细胞膜上的脂质与蛋白 从而破坏细胞膜 b 解聚细胞中的核蛋白 c 能与蛋白质结合成为 R O SO3 R 蛋白质的复合物 使蛋白质变性而沉淀下来 SDS 能抑制核糖核酸酶的作用 所以在接下来的提取过程必须把它去除干净 以便下一步 试验的更好进行 溶液溶液 pH4 8pH4 8 乙酸钾溶液 乙酸钾溶液 pH4 8 的乙酸钾溶液是为了把抽提液的 pH 调至中性 从而 使变性的质粒 DNA 复性 且稳定存在 溶液 III 加入后的沉淀实际上是 K 置换了 SDS 中 的 Na 形成了不溶性的 PDS 而高浓度的盐有利于变性的大分子染色体 DNA RNA 以 及 SDS 蛋白复合物凝聚 使得沉淀更完全 前者是因为中和核酸上的电荷 减少相斥力 而互相聚合 后者是因为盐与 SDS 蛋白复合物作用后 能形成较小的盐形式复合物 酚酚 氯仿液氯仿液 V V V V 1 1 1 1 用苯酚处理时 能使蛋白质变性 同时抑制了 DNase 的降解作 用 由于蛋白与 DNA 联结键已断 蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶 蛋白分子溶于酚相 而 DNA 溶于水相 使用酚能有效变性蛋白质 抑制了 DNase 的降 解作用 氯仿能克服酚的缺点 加速有机相与液相分层 去除核酸溶液中的迹量酚 酚易 溶于氯仿中 异戊醇的作用是减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡 异戊醇可以降低 表面张力 从而减少气泡产生 另外 异戊醇有助于分相 使离心后的上层含质粒 DNA 的水相 中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定 无水乙醇 无水乙醇 乙醇可以以任意比和水相混溶 而 DNA 溶液是 DNA 以水合状态稳定存在 同时乙醇与核酸不起化学反应 因此是理想的沉淀剂 加入乙醇后 乙醇会夺去 DNA 周 围的水分子 DNA 失水聚合 70 70 乙醇 乙醇 将质粒 DNA 表面的离子洗去 pHpH 8 08 0 TETE 缓冲液 缓冲液 由于缓冲液是 TrisH Tris 不存在金属离子的干扰作用 而 TE 缓冲液 中的 EDTA 更能稳定 DNA 的活性 酚与水有一定的互溶 苯酚用水饱和的目的是使其抽 提 DNA 过程中 不致吸收样品中含有 DNA 的水分 减少 DNA 的损失 用 Tris 调节至 pH 为 8 是因为 DNA 在此条件下比较稳定 在中性或碱性条件下 pH5 7 RNA 比 DNA 更容易游离到水相 所以可获得 RNA 含量较少的 DNA 样品 4 4 抽提质粒抽提质粒 DNADNA 的方法包括哪几个步骤 的方法包括哪几个步骤 答 DNA 提取分为三个基本步骤 1 破碎细菌细胞壁 加入去污剂除掉膜脂从而裂解细 胞 使蛋白质与 DNA 变性 利用醋酸盐沉淀基因组 DNA 细胞碎片与蛋白质 2 酚 氯 仿抽提 以除掉细胞内的蛋白 3 将 DNA 在冰乙醇中沉淀 因为乙醇与水互溶 而 DNA 在醇中不可溶而黏在一起 这一步也能除掉盐分 5 5 如何提高质粒如何提高质粒 DNADNA 的产量 的产量 答 第一是扩大质粒 DNA 的拷贝数 一般认为 培养 16 小时的菌液状态最好 最适合 提取 可以在此基础上扩大接种量 等比例扩大 LB 培养基的体积 采取多次抽提的方法 提高质粒 DNA 的产量 第二是在提取过程中小心谨慎 在加入苯酚 氯仿溶液离心之后小 心吸取的同时尽量吸取完全 减少损失 6 6 为什么质粒为什么质粒 DNADNA 不能反复在不能反复在 4 4 20 20 室温中放置 为达到这一目的 需要注意 室温中放置 为达到这一目的 需要注意 些什么 些什么 答 当质粒存放在 20 的条件下保存时 由于 TE 缓冲液中含有水分 会结成冰晶插入到 质粒 DNA 分子的间隙中 而在 4 条件下不会出现这种状况 若是质粒 DNA 分子反复 冻溶 水溶液的反复结冰会导致环状 DNA 分子断裂 导致得到线性的质粒 DNA 在接下 来的实验中将会影响到酶切与检测 为了保护质粒 DNA 分子不受到损害 应当将近期需 要使用的质粒存放于 4 冰箱保存 方便使用 而对于暂时不用的质粒 则应存放于 20 冰箱 长期保存 实验二实验二 DNADNA 的含量 纯度与分子量的电泳法测定的含量 纯度与分子量的电泳法测定 一 一 实验原理实验原理 测定核酸通常采用两种方法 即紫外分光光度法与琼脂糖凝胶电泳法 1 紫外分光光度法 DNA 或 RNA 定量时 应在 260nm 和 280nm 两个波长下读数 根据计算在 260nm 波长下 每 1ug mL DNA 钠盐的 A 值为 0 20 即在 A260 1 时 双链 DNA 含量为 50ug mL 单链 DNA 与 RNA 含量为 40ug mL 单链寡核苷酸的含量为 33 ug mL 双链 DNA 含量 A260 50 稀释倍数 ug mL RNA 含量 A260 40 稀释倍数 ug mL 单链 DNA 含量 A260 33 稀释倍数 ug mL 此外还可以根据 260nm 和 280nm 的读数间的比值 A260 A280 估计核酸的纯度 2 琼脂糖凝胶电泳法 根据 DNA 分子量不同 采用外加电场使其分开 用 EB 嵌入 DNA 分子后在紫外下显 荧光 而荧光强度正比于 DNA 的含量 如将已知浓度的标准样品表 2 1 作为电泳对照 就可以估计出待测样品的浓度 电泳后的琼脂凝胶糖直接在紫外灯下拍照 只需要 5 10ngDNA 就可以从照片上比较鉴别 由于电泳时所用的样品量非常少 只要将浓度控制在几十纳克即可 所以在基因工程 中经常被用做检测 DNA 样品 表 2 1 DNA Hind 中 DNA 片断 总 DNA 含量为 100 二 实验目的二 实验目的 1 从以上实验中提取到的质粒 DNA 为了能作下一步的酶切 连接及转化实验 必须测 定 DNA 的纯度 含量以及分子量大小 2 本实验旨在学习水平式琼脂糖凝胶电泳 学习检测 DNA 含量与相对分子质量大小 三 实验材料和试剂三 实验材料和试剂 材料 自制的质粒 DNA DNA Hind 试剂 1 标准 DNAmarker DNA Hind 2 限制性内切酶 EcoR 或Hind 和 10X 缓冲液 3 酶反应中止液 0 2 5 溴酚蓝 含 40 蔗糖 已配好 4 溴化乙锭染液 EB 使用前稀释 1000 倍 母液已配好 注意 EB 是一种诱变剂 配制和使用时应戴好手套 并且不能将该染液洒在桌面或地面上 使用后立即用大量 的水冲洗干净 5 0 5 TBE 缓冲液 Tris 2 18g 硼酸 1 10g EDTA Na20 14g 用蒸馏水定容至 400mL 可配成 5 TBE 母液 使用时稀释 10 倍即可 6 0 7 琼脂糖 仪器 仪器 37 水浴锅 微波炉 稳压电泳仪 凝胶成像系统 电泳槽 Eppendorf 架 恒 片段碱基对数目 kb相对分子质量DNA 含量 DNA 含量 ng mg 123 13015 0 10647 7476 9 29 4196 12 10619 4194 1 36 5574 26 10613 5135 2 44 3712 84 106989 9 52 3221 51 1064 847 9 62 0281 32 1064 241 8 70 5640 37 1061 111 6 80 1250 08 1060 32 6 温摇床 台式小型振荡器 Ep 管 1 5mL 加样器 20uL lmL 吸头 四 实验操作四 实验操作 一 质粒 一 质粒 DNADNA 的酶解的酶解 1 新提的质粒 在 10uL 的体系中用单一酶 如 EcoR 进行处理 即 质粒 DNA 5 L 10 缓冲液 1 L EcoR 0 5 L ddH2O 4 L 2 37 保温 30min 3 加入 1 10 体积的酶反应终止液 混匀以停止酶解反应 各酶解样品于冰箱中贮存备用 二 琼脂糖凝胶板的制备 二 琼脂糖凝胶板的制备 1 琼脂糖凝胶的制备 称取 1 0g 琼脂糖 置于锥形瓶中 加入 100mL TBE 缓冲液 于电炉上加热 注意 防止溢出 由于琼脂糖较难溶解 如果水分损失较大 则补充一定量的蒸馏水 使其终浓 度为 1 2 胶板的制备 将有机玻璃内槽洗净 晾干 取胶带纸将有机玻璃内槽的两端边缘封好 形成一个边 脚模子 注意 将橡皮膏紧贴在有机玻璃内槽两端边上 不能留空隙 将有机玻璃内槽置于水平位置 放好样品槽模板 一般称之为梳子 将冷却至 65 左 右的琼脂糖凝胶 小心地倒在内槽上 控制灌胶速度 使胶液缓慢地展开 直到整个有机 玻璃板表面形成均匀的胶层 室温下静置 1h 左右 待凝固完全后 轻轻拔出样品槽模板 撕去胶带纸 胶板上即形成相互隔开的样品槽 将有机玻璃内槽放入电泳槽中 加入 0 5 TBE 电泳缓冲液 以盖过胶板为宜 胶板内的样品小槽 3 加样 用移液枪将上述样品分别加入胶板的样品小槽内 每次加完一个样品为了避免交叉污 染 各样品用不同的枪头 以免造成限制酶被污染 加样时 枪头不要插入胶板内 防止 碰坏样品槽周围的凝胶面 每个样品槽的加样量不宜过多 本实验加样为 10uL 左右 每 块胶板需点一个 Marker 这里即为 DNA Hind 4 电泳 加完样品后应立即通电 进行恒压电泳 在低压条件下 线形 DNA 片段的迁移速度 与电压成比例关系 为了获得电泳分离 DNA 片段的最大分辨率 电场强度不应高于 5V cm 当溴酚蓝染料 蓝色 移动到距离胶板下沿约 1 2cm 处 停止电泳 5 染色 将电泳后的凝胶浸入 EB 染液中 进行染色以观察在琼脂糖凝胶中的 DNA 带 染色 20min 后 用大量水冲洗 6 观察 在波长为 254nm 的紫外灯下 观察染色后的电泳凝胶 DNA 存在处显示出红色荧光 条带 用凝胶自动成像仪处理代替 五 注意事项五 注意事项 1 基因工程是微量操作技术 DNA 样品与限制性内切酶的用量都极少 必须严格注意吸 样量的正确性 确认样品确实被加入反应体系 2 酶应在 20 冰箱中保存 取酶的操作必须严格在冰浴条件下进行 用完后立即放回 20 冰箱 不要将酶在冰浴中放置过久 或放在高于 0 以上的环境中 以防止酶失活 3 酶切加样次序为水 缓冲液和 DNA 然后混匀 酶永远是最后加入的 如将酶直接加 入浓缩的缓冲液中会引起严重的失水 酶切反应体系的溶液加完后 用手指轻弹管壁使溶 液混匀 也可用微量离心机甩一下 使溶液集中在管底 不要用振荡器 此步操作是整个 实验成败的关键 注意防止错加 漏加 4 为了避免交叉污染 各样品用不同的吸头 且每次取酶时务必换吸头 以免造成限制 酶被污染 5 溴化乙锭是一种强烈的诱变剂 有毒性 使用含有这种染料的溶液时 应戴手套进行 操作 勿将溶液滴洒在台面或地面上 用后用水彻底冲洗干净 六 实验结果与分析六 实验结果与分析 如图所示 M 为 Marker 泳道 1 为被酶EcoR I 所切后的质粒跑出来的条带 因为质粒 在酶切之前大都以超螺旋的形式存在 在酶切之后以线性形式存在 所以泳道 1 只有一条 条带 查资料知道 pEGFP N3 质粒的大小为 4729bp 大小基本符合 2 号泳道为未酶切 的对照组质粒 因为状态不同 所以显示出比酶切之后的条带跑的慢 分子量相同的超螺 旋环状 带切口环状以及线状 DNA 通过琼脂糖凝胶时速度不一 由图中看 酶切后的质 粒条带及未经酶切的质粒条带都不明亮 且对照组质粒的三条带不明显 说明提取的质粒 浓度较小 这三种 DNA 的相对迁移率主要取决于凝胶浓度 但也受所用电流强度 缓冲 液的离子强度及超螺旋度的影响 七 思考题七 思考题 1 1 简述简述 EBEB 显色的原理 显色的原理 答 溴化乙锭 EtBr EB 是芳香族荧光化合物 用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的核酸 是一 种核酸染料 常在琼脂糖凝胶电泳中用于核酸染色 是一种强的诱变剂 可能也是一种致癌物或致畸剂 EB 分子可以嵌入核酸双链的配对的碱基之间 在紫 外线激发下 未与核酸结合的溴化乙锭可被激发出 橙红色萤光 在与 DNA 或双股 RNA 结合时 萤光 强度会增强20倍 使得核酸电泳后的胶片可以辨识 核酸的相对位置 在核酸分子中 EB 分子插入到两 层碱基对之间 发出红色荧光 在凝胶中加入终浓 度为0 5 g ml 的 EB 可以在电泳过程中随时观察 核酸的迁移情况 这种方法使用于一般性的核酸检 测 2 2 使用溴化乙锭时应注意什么 使用溴化乙锭时应注意什么 答 不慎与眼睛接触后 立即用大量清水冲洗并征 求医生意见 穿戴适当的防护服 手套和护目镜或面具 若发生事故或感不适 立即就 避免皮肤接触 吸入有极高毒性 避免吸入 3 3 说明不同电压对电泳结果的影响是什么 说明不同电压对电泳结果的影响是什么 答 限制性内切酶消化后的 DNA 分子片段 低电压时 迁移率与所用电压成正比 在电 场强度增加时 不同分子量的 DNA 段的迁移率将以不同的幅度增长 片段越大 因场强 升高引起的迁移率升高幅度也越大 因此电压增加 琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小 原则上场强度不要超过 5V 8V cm 高电压可明显产热 严重时会引起凝胶熔化或 DNA 变性 使用 50V 左右的低电压可以让 DNA 分子片段沉降到胶孔中的适当位置 分散更加 均一后缓慢泳出加样孔 条带整齐集中 对于微量珍贵样本 1 50ng 和小片段样本 容易在凝胶中扩散消失 显色不清 尤其有利于观察到清晰结果 为了提高效率 节省 时间 在核酸条带浓缩集中后 10 20min 可以转换高电压 100V 当溴酚蓝条带移动 到距凝胶前沿约 0 5 1 0cm 时 停止电泳 综上 两种电压交替使用既提高分离效果 又较好节余时间 4 4 如何判断 如何判断 DNADNA 的纯度 的纯度 答 DNA 纯度的判断根据 OD260 OD280 的比值判断 符合要求纯度高的纯化 DNA 其 OD260 OD280 在 1 6 1 8 之间 低于此范围表明蛋白质含量超标 高于此范围表明样品 中含有 RNA 实验三实验三 感受态细胞的制备及转化感受态细胞的制备及转化 一 实验原理一 实验原理 感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态 只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外 来的 DNA 分子 转化是将外源 DNA 分子引入受体细胞 使之获得新的遗传性状的一种 手段 转化的基本原理是细胞处于 0 CaCl2低渗溶液中 细胞膨胀成球形 转化混合 物中的 DNA 形成抗 DNase 的羟基 钙磷酸混合物粘附于细胞表面 经 42 短时间热冲 击处理 促使细胞吸收 DNA 复合物 在选择性培养基平板上培养 可选出所需的转化子 二 实验目的二 实验目的 1 学习和理解影响细胞感受态的因素 掌握感受态细胞的制备方法 2 掌握质粒的转化方法 把体外 DNA 引入受体细胞 使受体菌具有新遗传性 并从中 选择出转化子 三 实验材料和用具三 实验材料和用具 材料 自制的质粒 DNA 大肠杆菌 E coli 菌种 DH5 菌株 试剂 LB 琼脂平板 无抗生素 LB 琼脂平板 含 50 g L 卡那霉素 LB 液体培养基 5mL 无抗生素 LB 液体培养基 100mL 无抗生素 LB 液体培养基 5mL 含 50 g L 卡那霉素 0 1mol LCaCl2溶液 灭菌备用 仪器 恒温培养箱 恒温摇床 接种环 涂布器 冷冻离心机 离心管 超净工作台 高压蒸汽 灭菌锅 四 操作步骤四 操作步骤 一一 大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备 1 从新活化的E coliDH5 菌平板上挑取一单菌落 接种于 5mL 液体培养基中 37 振 荡培养过夜 直至对数生长期 将该菌悬液以 1 50 接种于 50mL LB 液体培养基中 37 快速振荡培养 3 4h 2 取 5mL 培养液放入离心管中 在冰上放置 10min 于 4 5000rpm 离心 10min 3 可用移液枪将残余液体尽量去净 用 1mL 预冷的 0 1mol LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞 冰上放置 15 30min 4 于 4 5000rpm 离心 10min 5 弃上清 加入 200 L 预冷的 0 1mol LCaCl2溶液 小心悬浮细胞 冰上放置片刻 即 制成了感受态细胞悬液 6 制好的感受态细胞可在冰上放置 二二 细胞转化细胞转化 取 200 L 摇匀后的感受态细胞悬液 进行下一步的转化 转化如下 单位 L 样品组即为我们的转化组 100 L 感受态细胞 2 L 质粒 DNA 对照 1 为受体菌对照组 100 L 感受态细胞 2 L 无菌水 对照 2 为质粒 DNA 对照组 100 L0 1mol LCaCl2 2 L 质粒 DNA 将以上各样品轻轻摇匀 冰上放置 30min 后 于 42 水浴中保温 90s 然后迅速在 冰上冷却 3 5min 上述各管中分别加入 400 L LB 液体培养基 使总体积为 500 L 该 溶液称为转化反应原液 摇匀后于 37 振荡培养 30min 使受体细胞恢复正常生长状态 并使转化体产生抗药性 三 平板培养 取各样品培养液 100 L 分别接种于含卡那霉素和不含卡那霉素的 LB 平板培养基上 分别记为 Kan 和 Kan 涂匀 37 培养 24h 待菌落生长良好且未相互重叠时停止 培养 四 检出转化体 五 注意事项五 注意事项 1 这一个实验中的所有操作均要为无菌操作 在超净工作台内进行 2 细胞转化中 42 水浴 90s 要准确操作 3 制备感受态细胞过程中 需要在冰上放置的一定不要在室温中放置 6 6 实验结果与分析实验结果与分析 经过一夜培养后 第二天上午 9 点从烘箱中取出培养皿观察结果如下图所示 实验比 编号质粒感受态细胞无菌水 0 1mol LCaCl2 样品 2100 对照 1 1002 对照 2 2 100 不含抗生素培养基含抗生素培养基结果分析 受体菌对照组有大量菌落长出无菌落长出本实验未产生抗药性菌株 质粒对照组无菌落长出无菌落长出质粒 DNA 不含杂菌 转化实验组有大量菌落长出有菌落长出质粒进入受体菌中产生抗 药性 较成功 转化实验组的不含卡那的平板有大量菌落长出 含卡那的平板有少许菌落长出 对照组 1 即受体菌对照组不含卡那的平板有大量菌落长出 含卡那的平板没有菌落 对照 组 2 即质粒对照组不含卡那的平板上发现一个菌落 含卡那的平板没有菌落 转化实验组转化实验组 受体菌对照组受体菌对照组 质粒对照组质粒对照组 思考题思考题 1 1 感受态细胞制备好后 为什么在转化前还要在冰上放置 感受态细胞制备好后 为什么在转化前还要在冰上放置 答 感受态细胞制备后在冰上放置一段时间后再进行转化可提高转化率 在 0 摄氏度的氯 化钙低渗溶液中 菌细胞膨胀成球形 转化混合物中的 DNA 形成抗 DNase 的羟基 钙 磷酸复合物粘附于细胞表面 经 42 摄氏度短时间热冲击处理 促进