分子生物学遗传病基因诊断和治疗PPT课件.ppt

分子生物学讨论三之 遗传病的诊断与肿瘤基因治疗 1 遗传病的基因诊断 2 一 什么是遗传病 遗传病是指完全或部分由遗传因素决定的疾病 常为先天性的 也可后天发病 3 遗传病的类型 1 染色体病或染色体综合征 遗传物质的改变在染色体水平上可见 表现为数目或结构上的改变 2 单基因病 指一对等位基因的突变导致的疾病 分别由显性基因和隐性基因突变所致 3 多基因病 涉及多个基因起作用 与单基因病不同的是这些基因没有显性和隐性的关系 每个基因只有微效累加的作用 因此同样的病不同的人由于可能涉及的致病基因数目上的不同 其病情严重程度 复发风险均可有明显的不同 且表现出家族聚集现象 环境的影响较为显著 4 二 基因诊断 1 基因诊断概念2 基因诊断特点3 基因诊断应用范围4 基因诊断的发展过程5 基因诊断遇到的问题6 遗传病基因诊断的注意事项 5 基因诊断定义 某些受精卵或母体受到环境或遗传等的影响 引起的下一代基因组发生了有害改变 产生了疾病 为了有针对性的解决和预防 故需要通过实验室的基因诊断 基因分析才能得到确认 又称DNA诊断或分子诊断 6 基因诊断的特点 高特异性高灵敏度早期诊断性应用广泛性 7 基因诊断应用范围 1 检测病原生物的侵入 如肝炎 艾滋病等2 诊断先天遗传性疾患 产前诊断 优生学3 检测后天基因突变引起的疾病 如肿瘤4 其他比如亲子鉴定 法医物证 8 基因诊断的发展过程 1976年美籍华裔科学家简悦威应用液相DNA分子杂交技术成功地进行了镰形细胞贫血症的基因诊断 标志着人类遗传性疾病诊断开始进入基因诊断的新时代 9 发展过程 1 利用连锁分析和关联分析定位遗传病致病基因 2 利用分子杂交技术进行遗传病的基因诊断 3 利用PCR技术进行遗传病的基因诊断 4 基因芯片用于基因诊断 5 利用外显子组捕获技术诊断单基因遗传病 6 利用全基因组 GWAS 关联分析定位及诊断多基因遗传病易感基因 10 相关问题 1 标准化问题 缺乏标准化的操作规程以及质量认证体系 各医疗机构的操作方法不统一 质量难保证 2 伦理学问题 3 所用资源及信息安全问题 11 需要相对明确临床诊断需要及时向患者及其家属说明基因诊断的重要性 以启发上述成员的理解与主动性需要在基因诊断中建立家系观点需要注意基因诊断中的伦理问题需要正确理解基因诊断报告需要充分理解产前基因诊断的风险 遗传病的基因诊断的注意事项 12 三 基因诊断方法 1 核酸分子杂交2 聚合酶链反应3 单链构象多态性分析4 限制性片段长度多态性连锁分析5 DNA序列测定6 单核苷酸多态性和全基因组关联分析7 生物芯片8 WESTERN免疫印迹9 环介导等温核酸扩增技术10 免疫组织化学诊断11 外显子组捕获技术 13 3 单链构象多态性 单链DNA呈现一种由内部分子相互作用形成的三维构象 这种构象由碱基顺序决定 碱基变异则构象改变 而构象影响了DNA在非变性凝胶中的迁移率 相同长度但不同核苷酸序列的DNA由于在凝胶中的不同迁移率而被分离 迁移率不同的条带可被银染或者荧光标记引物检测 然后用DNA自动测序进行分析 14 4 限制性片段长度多态性 该技术是利用限制性内切酶能识别DNA分子的特异序列 并在特定序列处切开DNA分子 即产生限制性片段的特性 如果重排 缺失或者核苷酸置换使内切酶识别序列变成了不能识别序列或是这种差别使本来不是内切酶识别位点的DNA序列变成了内切酶识别位点 这样就导致了用限制性内切酶酶切该DNA序列时 就会少一个或多一个酶切位点 结果产生少一个或多一个的酶切片段 这样就形成了用同一种限制性内切酶切割不同物种DNA序列时 产生不同长度大小 不同数量的限制性酶切片段这种变化即可作为诊断指标 15 6 单核苷酸多态性和全基因组关联分析 单核苷酸多态性 主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性 16 全基因组关联分析 英文名字叫Genome wideassociationstudy简称 GWAS 全基因组关联分析 是指在人类全基因组范围内找出存在的序列变异 即单核苷酸多态性 SNP 从中筛选出与疾病 性状相关的SNPs 17 7 生物芯片 又称为基因芯片 genechip DNA微阵列 DNAmicroarray DNA芯片技术基础是核酸分子杂交 18 应用微电子加工工艺 在玻璃 塑料 硅片等材料上制备用于生物样品分离 反应或分析的微细结构目前主要有两大类 1 生物活性微阵列 bioactivemicroarray 2 基因芯片 genechip DNA微阵列 DNAmicroarray 包括多肽 蛋白质 病毒 细胞等 蛋白质芯片可直接从体液中检测生物分子 免疫芯片只需少量样品可一次完成对成千上万种抗原或抗体等致病因素或生物样品的检测分析 为最重要的生物芯片 广泛用于基因表达谱分析 新基因发现 基因突变及多态性分析 疾病诊断 药物筛选 基因测序等 19 20 21 9 环介导等温核酸扩增技术 其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物 利用一种链置换DNA聚合酶 BstDNApolymerase 在等温条件 65 左右 保温几十分钟 即可完成核酸扩增反应 22 10 免疫组织化学诊断 对于某些基因表达水平发生改变的疾病可以采取免疫组织化学方法进行诊断 优点是在不改变细胞结构的情况下 对基因表达终产物 蛋白质水平及细胞中的部位进行分析 23 外显子捕获 exontrapping 是构建一种载体 从其插入片段中识别和回收外显子序列 从而克隆目的基因 24 25 26 27 遗传病的基因诊断 典型案例 28 主要内容 甲型血友病脆性X染色体综合征成年型多囊肾病DMD BMD的缺失型脊髓小脑性共济失调 29 甲型血友病 血友病为一组遗传性凝血功能障碍的出血性疾病 其共同的特征是活性凝血活酶生成障碍 凝血时间延长 终身具有轻微创伤后出血倾向 重症患者没有明显外伤也可发生 自发性 出血 血友病可分为甲型 乙型 丙型和血管性假血友病4种 其中甲型发病率占人类先天性血液系统疾病的85 甲型血友病 即因子 促凝成分 C 缺乏症 也称AGH缺乏症 是一种性联隐性遗传疾病 女性传递 男性发病 甲型血友病的基因诊断主要鉴定患者家系中的携带者或对未出生的胎儿进行产前诊断 30 甲型血友病的基因诊断 1 1 F 基因到位的DNA印记分析 1 将基因组用限制性内切核酸酶消化2 用特异探针杂交 放射自显影分析2 F 基因突变直接检测 1 依赖于F 基因内或旁侧的多态性的连锁分析2 RFLP连锁分析3 VNTR分析4 STR连锁分析对于甲型血友病进行基因诊断首先寻找有无基因到位 其次利用基因内的遗传标志进行连锁分析 最后采用PCR SSCP或PCR DGGE分析 31 脆性X染色体综合征 脆性X染色体综合征导致患者智障 Martin Bell综合征 脆性X综合症是由于在人体内X染色体的形成过程中的突变所导致 在X染色体的一段DNA 由于遗传的关系有时会发生改变 一种为完全改变 另一种为DNA过度甲基化 如果这两种改变的程度较小 那么患者在临床表现方面可以没有特殊的症状或者只有轻微的症状 反之 如果这两种改变的程度较大 就可能出现如下所述的脆性X综合症的种种症状 32 脆性X染色体综合征基因诊断 常用的方法 1 PCR ASO 2 DNA连锁链分析 3 Southern印迹杂交法 4 PCR扩增 33 成年型多囊肾病 成年型多囊肾病是一种常染色体显性遗传病 发病率高 约1000人中有1名致病基因的携带者 起病较晚 多在30岁以后 主要为肾和肝中出现多发性囊肿 临床表现为腰疼 蛋白尿 血尿 高血压 肾盂肾炎 肾结石等 最终可导致肾功能衰竭和尿毒症 诊断 本病基因定位在16p13 与 珠蛋白基因3 端相邻 但致病基因尚未克隆 基因产物的生化性质和疾病发病机理也尚未阐明 因此 只能用连锁分析来进行基因的发病前诊断和产前诊断 由于通过家系分析 已证实APKD的致病基因与 珠蛋白基因3 端附近的一段小卫星DNA序列即3 HVR 3 hypervariableregion 紧密连锁 而后者在人群中具有高度多态性 因此可以通过RFLP连锁分析进行诊断 34 DMD BMD的缺失型 DMD BMD是一种 连锁隐性遗传的神经肌肉系统受累的致死性遗传病 DMD BMD有70 左右为缺失型 诊断 此基因很大 缺失可发生在不同部位 因此应尽可能采用多对引物作PCR扩增 多重PCR 来检测 如扩增产物电泳后发现有带纹的缺失 即可作出诊断并对缺失定位 图13 9 在进行产前诊断时 一般可先通过检测家系中有关成员 即确定先证者的缺失区 然后有针对性地作PCR扩增 包括缺失部分的两端 以判断胎儿或有关患儿是否也获得了相同的基因缺失 但非缺失型不能用此法查出 35 脊髓小脑性共济失调 脊髓小脑性共济失调是以小脑性共济失调为主要症状的常染色体显性遗传性疾病 病理改变以小脑 脊髓 脑干变性为主 临床主要特征为小脑性共济失调 可伴有构音障碍 震颤 锥体束征以及痴呆等 诊断 依据神经系统临床检查的程序来判断患者是否存在小脑及脊髓神经失调的临床体征 然后会查问他的家族史 包括已故的亲人 最后结合磁共振 MRI 及基因测试 排除其他累及小脑和脑干的变性病 才能判断患者是否患上脊髓小脑性共济失调 36 遗传病的基因诊断 以血红蛋白病为例 37 血红蛋白病 血红蛋白病 hemoglobinopathy 是由于血红蛋白分子结构异常 异常血红蛋白病 或珠蛋白肽链合成速率异常 珠蛋白生成障碍性贫血 又称海洋性贫血 所引起的一组遗传性血液病 临床可表现溶血性贫血 高铁血红蛋白血症或因血红蛋白氧亲和力增高或减低而引起组织缺氧或代偿性红细胞增多所致紫绀 38 异常血红蛋白病 镰刀状红细胞贫血 Hbs 不稳定血红蛋白病 unstablehemoglobinpathies 血红蛋白M病 HbM 氧亲和力改变的血红蛋白病 39 地中海贫血 地中海贫血 thalassemia 简称 地贫 地中海贫血 梩halassemia 简称 地贫 40 镰刀状红细胞贫血 Hbs 异常血红蛋白 链的第6位谷氨酸被缬氨酸所代替 这个疏水氨基酸正好适合另一血红蛋白分子 链EF角上的 口袋 这使两条血红蛋白链互相 锁 在一起 最终与其他血红蛋白链共同形成一个不溶的长柱形螺旋纤维束 使红细胞扭旋成镰刀形 41 诊断方法 镰刀形细胞性贫血症的基因诊断可采用PCR 限制性内切酶谱分析法 先用PCR从患者基因组DNA扩增含突变位点的珠蛋白基因片段 再选择适当的限制性内切酶水解PCR产物 根据酶切产物在电泳图谱上的片段数量和大小做出判断 也可与特意的寡核苷酸探针进行Southern印记杂交分析 根据杂交图谱做出判断 42 限制性内切酶 采集制备血液DNA内切酶Mst 消化电泳转膜P32标记的 珠蛋白cDNA杂交放射自显影 43 PCR 限制性内切酶 设计引物PCR扩增产物进行限制性内切酶酶切电泳EB染色直接观察 44 地中海贫血 地中海贫血 mediterraneananemia 是指 链的合成受部分或完全抑制的一组血红蛋白病 患儿出生时无症状 多于婴儿期发病 生后3 6个月内发病者占50 偶有新生儿期发病者 发病年龄愈早 病情愈重 严重的慢性进行性贫血 需依靠输血维持生命 3 4周输血1次 随年龄增长日益明显 45 地中海贫血基因诊断 PCR ASO斑点杂交法合成两对PCR引物合成等位特异寡核苷酸探针制备DNA样品PCR扩增斑点印迹杂交RFLP分析法 46 肿瘤基因治疗 47 48 49 50 51 52 53 54 基本策略和常用方法 55 基本策略 一 治疗性基因的获得 二 基因载体的选择 三 靶细胞的选择 四 基因转移方法 五 转导细胞的选择鉴定 六 回输体内 56 一 目的基因的选择和制备基因治疗的首要问题是选择用于治疗疾病的目的基因 要求 在体内仅有少量的表达就可显著改善症状 该基因的过高表达不会对机体造成危害 在抗病毒和病原体的基因治疗中 所选择的靶基因应在病毒和病原体的生活史和起重要的作用并且该序列是特异的 制备目的基因 正向表达的基因可以是cDNA complementaryDNA 也可是基因组DNA genomicDNA 片段 可用传统的方法 人工合成 获取 也可采用多聚酶链式反应 polymerasechainreactionPCR 等新技术进行体外扩增 部分反义基因也可采用此法获得 但多数情况下采用人工合成的方式制备 57 二 基因的转运目前已有多种基因转运的方式 其基本原则是将外源基因运到细胞内 已使用的有病毒载体和非病毒载体两大类 58 病毒载体 病毒具有一些独特的性质如多数病毒可感染特异的细胞 在细胞内不易降解 RNA病毒能整合到染色体以及基因水平较高等 因此病毒载体是良好的基因转运载体 目前已被用作载体的病毒有逆转录病毒 腺病毒 腺相关的病毒 疱疹病毒和肝炎病毒等 逆转录病毒用作载体时需进行几步改造 1 将天然的野生型RNA前病毒转变成DNA载体 并插入欲转移的相关外源基因 其基本原则是用标记基因和外源基因替代病毒的编码基因示 2 制备辅助细胞为载体DNA提供其丧失的功能 3 将载体DNA导入辅助以产生病毒载体 4 病毒载体感染靶细胞 外源基因在细胞内得以表达 59 非病毒载体 这类载体的发展较快 目前主要是脂质体 60 常见基因转运载体的优缺点 61 62 三 靶细胞的选择理论上讲 无论何种细胞均具有接受外源DNA的能力 目前基因治疗中禁止使用生殖细胞作为靶细胞 而只能使用体细胞 用于转基因的体细胞必须取材方便 含量丰富 容易培养 寿命较长 可选择的细胞有淋巴细胞 造血细胞 上皮细胞 角质细胞 内皮细胞 成纤维细胞 肝细胞 肌肉细胞和肿瘤细胞等 在实际上应用中应具体根据目的条件选择 63 四 细胞转染这是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术 随着基因与蛋白功能研究的深入 转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法 转染大致可分为物理介导 化学介导和生物介导三类途径 电穿孔法 显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例 化学介导方法很多 如经典的磷酸钙共沉淀法 脂质体转染方法 和多种阳离子物质介导的技术 生物介导方法 有较为原始的原生质体转染 和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术 64 65 66 五 外源基因的表达及检测在筛选出转化分子后还需要鉴定转导细胞中外源基因的表达状况 其中包括对目的基因和标记基因表达的鉴定 常用方法有原位杂交 Northrn杂交 NRA打点杂交 免疫组织化学染色等 前几项是检测外源基因转录出的mRNA 后者则是检测外源基因翻译出的蛋白质 67 常用方法 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 补偿性基因治疗补偿性基因治疗是指向缺失某种抑癌基因的细胞内导入正常的抑癌基因 逆转肿瘤细胞的表型 抑制细胞增殖 诱导细胞凋亡 以达到治疗目的 用基因替代等方法可恢复和增强肿瘤抑制基因的功能 如将克隆的抑癌基因Rb p53 p16等导人肿瘤细胞 可以逆转其恶性行为 诱导细胞凋亡 但是由于肿瘤发生 发展的机制十分复杂 涉及多种癌基因和抑癌基因的多步骤改变 因而难以通过拮抗某一种癌基因完全控制肿瘤的恶性行为 82 抗肿瘤血管形成基因治疗肿瘤的生长 转移与新生血管的形成密切相关 因此抗血管形成基因治疗是非常有潜力控制肿瘤生长的治疗方法 抗肿瘤血管形成基因治疗的研究主要包括 针对血管形成生长因子及其受体的基因治疗 血管形成抑制因子基因治疗 针对肿瘤血管内皮细胞的自杀基因治疗等 83 肿瘤耐药基因治疗 即化疗保护性基因治疗 是指化疗前向骨髓内导入耐药基因 保护骨髓细胞不受抗肿瘤药物的损害 有实验表明 将药物剂量提高5 10倍可以克服肿瘤细胞的抗药性 但大剂量化疗对人体正常组织及造血系统的损害较重 限制了化学药物的用量 84 多耐药基因 MDRl 编码P糖蛋白的跨膜蛋白 它有抗肿瘤药物位点和ATP位点2个结合位点 通过ATP供能可将细胞内药物泵出从而保护正常细胞免受药物损害 目前 肿瘤耐药基因治疗的方案是转入MDRI基因 DHFR基因 MGMT基因等 或者联合使用2种或多种耐药基因转入造血干细胞 使造血干细胞获得广谱抗药性 85 自杀基因疗法 自杀基因疗法又称为病毒导向的酶解前药疗法其原理是将一些病毒或细菌基因组中的前药转换酶基因 也叫自杀基因 导入肿瘤细胞 该基因编码特殊的酶可将原先对高等动物无毒性的前药在肿瘤细胞中代谢为毒性产物 从而引起这些细胞自杀 其作用是 促进免疫效应细胞的分化增殖 加强对肿瘤的杀伤力 直接杀伤癌细胞 增加肿瘤细胞的免疫原性 86 87 88 89 基因联合治疗 由于肿瘤是多因素 多环节 多阶段的复杂疾病 依靠单一方法并不能达到理想的抗肿瘤效果 因此多种治疗联