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精品文档miR-532功能的初步研究之前的工作表明，在红系分化过程中miR-532具有广泛的调控作用，如下图（未发表数据）：功能研究的常见流程：找到感兴趣的基因构建过表达或敲低的克隆转染细胞获得过表达或敲低的细胞系验证过表达或敲低是否成功检测相关基因的表达水平观察是否有表型变化更好的研究模型上确定该基因的功能机制的探索各种方法证明机制。你需要做的：在293T和K562细胞中初步探索miR-532的调控情况。一、293T细胞1、复苏并培养293T细胞。另外记得要及时冻存细胞。2、pcDNA和pcDNA-miR-532分别转染293T细胞。1） 转染只需6孔板中进行；2） 转染步骤，质粒、试剂的用量等请参考以前的实验记录和Lipo2000官方protocol；3） 48小时后用TRIZOL收细胞，提RNA。3、验证过表达是否成功。1） 分别取293T-pcDNA和293T- pcDNA-miR-532的RNA 1 ug，加poly（A）尾，再用特殊的引物反转录，获得cDNA。（这与我们平时反转录获得的cDNA不一样，姑且叫mi-cDNA）。2） qPCR:模版为293T-pcDNA和293T- pcDNA-miR-532的mi-cDNA，target（引物）为U6和miR-532。3） 如果结果表明miR-532过表达成功，则进入下一步。4、检测红系相关基因的表达。主要就是qPCR，模版为293T-pcDNA和293T- pcDNA-miR-532的cDNA，target（引物）为GAPDH，多个珠蛋白基因，GATA-1和KLF1。二、K562细胞步骤基本同上，需要注意的是：1、 K562为悬浮细胞，培养方法不同2、 转染K562细胞采用的是电转的方法。欢迎您的下载，资料仅供参考！致力为企业和
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