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肿瘤病理诊断基础 北京肿瘤医院病理科李向红2015 06 08 1 精准医学时代的肿瘤病理诊断 美国总统奥巴马于今年1月20日发表国情咨文的演讲中宣布 今晚 我将启动一个崭新的精准医学计划 这将使我们距离治愈癌症和糖尿病等疾病更进一步 并且 这将使我们所有人利用个性化信息让自己的家人更健康成为可能 2 精准医学时代的肿瘤病理诊断 精准医学 precisionmedicine 又称为精准医疗 是指基于每个个体的基因差异而制定的个性化治疗方案 正如量体裁衣才能制作出合身的衣服一样 这样的医疗比传统医疗才会更加有效 3 医院病理科的主要任务是为病人的诊治提供临床需要的重要信息 病理诊断在疾病 肿瘤 的诊断 治疗的选择和预后的判断中有着不可替代的作用 精准医学时代的肿瘤病理诊断 4 精准医学时代的肿瘤病理诊断 精准医学的首选目标是癌症 在精准癌症医学 precisioncancermedicine 模式中 癌症的精准诊断是精准治疗的重要保证 在精准诊断中 病理医师起着不可替代的关键作用 以往 病理医师通过光学显微镜 电子显微镜 特殊染色和免疫组化化学等方法对肿瘤分类和分型 这种基于组织起源的传统分类没有考虑各种类型肿瘤其下的基因改变 5 精准医学时代的肿瘤病理诊断 在精准医学时代 病理医师需要依据各种基因检测方法 包括荧光原位杂交 FISH 比较基因组杂交 CGH 聚合酶链反应 PCR 和实时定量PCR qRT PCR Sanger测序以及技术 如基因表达谱 GEP 阵列CGH和二代测序 NGS 等对肿瘤进行分子分型 或分子诊断 这些分子分型中的各个亚型常与患者预后相关 因此也与个性化治疗相关 6 病理学在医疗实践中的地位Asisourpathologysoisourpractice Medicine 病理医生在医疗实践中的地位 whatthepathologistthinkstoday thephysiciandoestomorrowSirWilliamOslerHehasbeencalledthe Fatherofmodernmedicine Oslerwasamultifacetedphysicianandindividual functioningasapathologist internist educator bibiliophile historian author andrenownedpracticaljoker 精准医学时代的肿瘤病理诊断 7 一般来讲 生活中最成功的人是那些获得最佳信息的人 Asageneralrule themostsuccessfulmaninlifeisthemanwhohasthebestinformation BenjaminDisraeli 精准医学时代的肿瘤病理诊断 8 精准医学时代的肿瘤病理诊断 获取人体组织和体液中所含有的肿瘤相关信息Theinformationoftissueandfluidsreflectthedisease 解剖病理 组织病理 免疫组化 原位杂交 9 精准医学时代的肿瘤病理诊断 病理能反映活组织的状态能够追寻疾病的起始和终结需要丰富的临床医学背景知识和渊博的组织诊断技术知识病理诊断的准确性依赖于临床医生输入的信息 应了解其潜力和局限性 RosaiandAckerman sSurgicalPathology 10thEd2011 Elsevier Nodularhyperplasiaofprostate 10 精准医学时代的肿瘤病理诊断 套细胞淋巴瘤 CyclinD1 11 组织中的信息反映个体的差异 Romondetal NEJM2005 353 16 Panvichianetal ApplImmunohistochemMolMorphol2012 HER2打开了外科病理学通向个体化医疗之门 12 肿瘤病理在个体化医疗中的独特地位 13 CompanionDiagnostics TraditionaloncologyparadigmTrial error onedrugfitsall Personalizedhealthcare Therightdrugfortherightpatient Treatment 肿瘤病理在个体化医疗中的独特地位 PHCimproveshealthandmonetaryefficiency PHC CompanionDiagnosticsModel 14 常用病理诊断技术 HE常规病理技术 组织形态特殊染色技术 糖原 脂肪 胶原 弹力纤维等免疫组织化学 IHC 技术 检测蛋白荧光定量PCR DNA RNA 突变 融合原位杂交 FISH SISH 技术 DNA RNADNA测序技术 DNA突变生物芯片技术 DNA RNA 蛋白质等NGS技术 15 常用病理诊断技术 16 常用病理诊断技术 17 常用病理诊断技术 18 多学科平台在病理诊断中的作用 JournalofThoracicOncology6 2 2011 STATEOFTHEART CONCISEREVIEW 19 Multidisciplinaryapproachtodiagnosisoflungadenocarcinom WHO的肺癌分类 1967 1981 and1999 是病理医生为病理医生写的 2004的修订引入了相关的分子遗传和临床信息近6年来 由于临床肿瘤学 分子生物学以及放射影像学在肺腺癌领域的显著进步 迫切需要有一个新的修订的分类 不仅仅基于病理学 而且基于多学科整合的平台 20 Multidisciplinaryapproachtodiagnosisoflungadenocarcinom 目的是提供一个整合了临床 影像 分子和病理的途径来对各种肺腺癌进行分类 这一分类能够帮助明确具有特征性的临床 影像 分子和病理特点的各种类型 以能够确认预后和预测的因素和治疗的靶点 21 Diagnosis Clinical Radiologicfeatures Morphology Immunologicandbiologicmarkers Multidisciplinaryapproachtodiagnosisoftumor 22 组织分型和分子改变的相关性 23 组织分型和分子改变的相关性 24 组织分型和分子改变的相关性 25 分子病理学引起肿瘤治疗模式的变化 肺癌分子诊断与靶向治疗 EGFR基因突变 KRAS突变 EML4 ALK融合 基因表达定量分析 ERCC1 RMM1 以上是NCCN指南明确指定基因 其它基因包括B Raf PIK3CA基因突变等及预后基因 26 KrisMG etal 2013WCLCPL03 07 根据肺癌驱动基因定制治疗方案可延长患者生存期 肺癌突变联盟 LCMC1 0 研究结果 分子病理学引起肿瘤治疗模式的变化 27 分子病理学引起肿瘤治疗模式的变化 28 CurrentStandardofNSCLCCare 2010NCCN 分子病理学导致临床病理分型的演变 NCCNGuidelinesVersion3 2014ofNon SmallCellLungCancerHornL PaoW JClinOncol 2009 26 4232 4235 驱动基因分型 29 分子病理学引起肿瘤治疗模式的变化 肠癌KRAS BRAF基因突变检测与西妥昔单抗 帕尼单抗疗效的预测MMR基因缺陷或者修饰与氟尿嘧啶类单药辅助方案疗效及预后评价 胃癌Her 2基因扩增与曲妥珠单抗的使用 GIST中c KIT PDGFRA的突变与格列卫 以上是NCCN指南明确指定基因 其它如抗EGFR VEGFR等靶向药物的使用 胃肠消化系统疾病分子诊断与靶向治疗 30 分子病理学引起肿瘤治疗模式的变化 2011 08美国FDA同时批准了罗氏公司的黑色素瘤靶向药物Zelboraf和伴随基因检测 试剂和设备 highlightingtheprocessasamodelforfutureRx Dxco developmentstrategies 31 病理医生应位于个体化医疗的中心 Atthecenterofpersonalizedmedicineisdiagnostics andatthecenterofdiagnosticsisthepathologist 病理医生必须适应伴随诊断的时代病理医生应在决定是否要做检测 用什么方法做检测及检测结果的意义方面提供权威的意见病理医生应了解样本 形态以及药物反应和可能发现的突变之间的关系病理医生应该了解诊断和治疗反应的方方面面 能够综合所有的信息并告诉 educate 临床医生 32 病理医生 决策 支持 医学文献 大体病理 组织学 影像诊断 蛋白质组学和IHC 基因组学 遗传学 流行病学 结果 病人 结果反馈 Patient 临床医生 日常管理 诊断 治疗 其他 flow EM 电子数据层 临床病历 临床实验室 atthecenterofdiagnosticsisthepathologist 33 34 免疫组化在病理诊断中的意义 诊断和鉴别诊断预后判断 预后标志物指导治疗和靶向药物的选择 预测标志物与分子病理学的关系 immunogenetic 35 预后和预测标志物 预后标志物 prognosticbiomarker 能够提供肿瘤患者自然病程信息的生物标志物预测标志物 predictivebiomarker 能够确认对某一治疗反应最好的患者群的生物标志物 36 预后和预测标志物 Prognosis Prediction Thefigureillustratesthedifferencebetweenaprognosticandapredictivebiomarker Prognosticbiomarker Indicatesthelikelycourseofthediseaseinanuntreatedindividual Predictivebiomarker Identifiessubpopulationsofpatientswhoaremostlikelytorespondtoagiventherapy Thebluepatientistheonewhowillbenefitfromtreatmentindividual Blueandredpatientsarethosewhowillrelapse 37 免疫组化在病理诊断中的意义 IHC作为替代的标志物 间接反映基因水平的分子改变 肿瘤特异性的染色体易位 肿瘤特异的基因突变 基因缺失 功能获得或丧失 基因扩增 38 免疫组化在病理诊断中的意义 免疫遗传学immunogenetics通过免疫组化的方法来反映基因的改变了解疾病或肿瘤的发病机制帮助诊断协助预后判断预测药物的选择和反应 39 免疫组化在病理诊断中的意义 免疫组化技术的进步 能够检测到非常低表达的抗原对肿瘤分子改变日益深入的了解可获得许多新的抗体 包括兔单抗 针对基因突变的单抗是一种简单且不昂贵的方法来提示特异性的分子改变 40 免疫组化在病理诊断中的意义 肿瘤特异性的染色体易位 滤泡性淋巴瘤的Bcl 2基因融合和蛋白表达 41 胃肠道间质瘤的C Kit基因突变和免疫组化CD117染色预测Glivec治疗的反应 肿瘤特异的基因突变 557 558号密码子的缺失AGTGGA 560号密码子的突变TA 免疫组化在病理诊断中的意义 42 对于某些淋巴瘤 免疫组化标志可提供额外的预后信息 如 弥漫大B细胞淋巴瘤 GCB预后好 非GCB预后差 间变大细胞淋巴瘤 ALK 亚型比ALK 亚型预后好 ZAP 70表达提示B CLL预后差 增殖指标Ki 67高提示预后差 预后判断 43 A GCBB non GCB 44 生发中心性 GCB 1 CD10 2 CD10 Bcl 6 MUM1 非生发中心性 non GCB 1 CD10 Bcl 6 MUM1 2 CD10 Bcl6 预后判断 45 ALK1 预后判断 46 PrimarysystemicformofALCLOverallsurvival 0 5 10 Years ALCL t 2 5 orALK 100 50 ALCL t 2 5 orALK Falinietal 1999 47 指导治疗和靶向药物的选择 CD20 弥漫大B细胞淋巴瘤CD20阳性指导美罗华的应用 48 49 HER 2与乳腺癌 1983Weinberg和他的同事发现HER 2 HER 2 neu c erbB 2 基因 位于17号染色体 编码跨膜酪氨酸激酶受体 属于表皮生长因子受体或HER家族 50 HER2 HER 2与乳腺癌 51 HER 2与乳腺癌 10 34 的浸润性乳腺癌有HER 2基因的扩增和 或蛋白的表达HER 2过表达常见于高级别和广泛的导管原位癌以及粉刺癌低水平的HER 2 neu过表达见于良性乳腺病变 与发生浸润性导管癌的高风险相关 52 HER 2基因的扩增与HER 2 p185neu 蛋白过表达相关乳腺癌HER 2基因的扩增与细胞的增殖 运动 浸润 局部和远处转移 血管生成以及凋亡相关HER 2阳性的乳腺癌更多为中等或高组织学级别 多缺乏ERs和PRs ERandPRnegative 并常伴有淋巴结转移 HER 2与乳腺癌 53 在107项涉及39 730例病人的研究中 95项 88 通过单因素或多因素分型明确了无论是HER 2基因的扩增还是HER 2 p185neu 蛋白的过表达都能预测乳腺癌的预后在93项多因素分析研究中 68项 73 显示了HER 2基因 mRNA或蛋白过表达是独立的不良预后因子 HER 2与乳腺癌 54 FISHHer 2基因无扩增 FISHHer 2基因高倍扩增 HER 2与乳腺癌 55 SISHHer 2基因无扩增 SISHHer 2基因高倍扩增 HER 2与乳腺癌 56 HER 2与乳腺癌 HER 2靶向治疗HER 2靶向治疗前 HER 2 阳性的乳腺癌容易早期转移到腋窝淋巴结 骨髓 肺 肝 肾上腺和卵巢 HER 2靶向治疗后 发生其他器官的转移减少 而CNS的转移更多见 57 HER 2检测HER 2阳性状态与乳腺肿瘤的预后差相关HER 2是肿瘤复发和总生存期长短的独立预后因子HER 2是有别于肿瘤大小 淋巴结及激素受体外的重要预后因子 HER 2与乳腺癌 58 累计生存率 RossJS FletcherJA StemCells1998 16 413 428 HER 2阳性状态的患者无病生存期亦缩短 淋巴结阴性 0122436486072 淋巴结阳性 HER 2与乳腺癌 59 四大国际多中心临床研究 13000病例 一致显示 赫赛汀辅助治疗可以降低HER 2阳性早期乳腺癌复发风险 HER 2与乳腺癌 60 赫赛汀的副反应心脏毒性反应 赫赛汀的心脏不良反应发生主要与蒽环类药物同时使用时出现 对既往有心脏病史或射血分数 50 用药前应特别慎重 用药期间应持续监测心脏功能 严重副反应 严重副反应通常发生在首次输注赫赛汀2h内 表现为呼吸困难 气管痉挛 呼吸道窘迫等呼吸系统症状 一些患者可以出现低血压 皮疹等过敏反应 HER 2与乳腺癌 61 IHC半定量检测蛋白表达 IHC0 IHC1 IHC3 IHC2 HER 2检测方法 HER 2与乳腺癌 62 FISH检测基因扩增 FISH阴性HER 2 CEP17ratio 2 0 FISH阳性HER 2 CEP17ratio 2 0 CEP17 chromosomeenumerationprobe17 HER 2与乳腺癌 HER 2检测方法 63 HER 2检测流程 Positive3 ReportedasHER 2positive Eligiblefortreatment IHC Equivocal2 FISH ISH HER 2与乳腺癌 64 HER 2检测存在的问题检测结果存在明显的误差HER 2检测误差导致的结果18 的患者接受了不必要的靶向治疗 10 的患者丧失了获得靶向治疗的机会 其中一半病人可延长生命 化疗联合赫赛汀 单纯化疗 赫赛汀辅助治疗显著改善无进展生存时间 HER 2检测 问题 HER 2与乳腺癌 65 导致误差的原因HER检测与普通IHC染色的差别没有相应的质量保证体系 HER 2与乳腺癌 66 HER2检测缺陷的纠正2007ASCO CAP发布了乳腺癌HER2指南2009中华病理学杂志发表了乳腺癌HER2检测指南 2009版 2013ASCO CAP更新了乳腺癌HER2指南2014中华病理学杂志发表了乳腺癌HER2检测指南 2014版 HER 2与乳腺癌 67 HER2检测指南传达的重要信息HER2检测不再是一种单纯用于诊断的IHC或FISH染色HER2检测的结果是独立的预测和预后指标 会导致治疗的重大差别病理医师提供给临床医师和患者的HER2检测结果必须是正确的 HER 2与乳腺癌 68 HER2检测的重要影响因素标本的处理固定液的种类和固定时间不能检测和评估的标准试剂的选择方法的有效性结果的判读IHC和FISH报告的内容 HER 2与乳腺癌 69 HER 2与胃癌 2009公布的ToGA试验结果被称为赫赛汀的又一个里程碑 Herceptinlandmarkstudy 70 HER 2与胃癌 ToGA是第一个随机对照的III期临床试验 目的是研究曲妥珠单抗治疗HER2阳性且无法手术的局部进展期和复发 转移胃癌的作用约3800例胃癌病人进行了检测 594例HER2阳性病人进入治疗组594例病人进一步分成两组进行两种方案的一线治疗 71 对324例胃癌病例的HER2状态进行IHC和FISH检测 106例弥漫型胃癌中5例HER2阳性 4 7 218例肠型胃癌中179例HER2阳性 17 9 HER 2与胃癌 HER 2FISH HER 2IHC 72 HER2 positivecasesrandomisedbetweentreatmentarms HER 2与胃癌 73 HER 2与胃癌 ToGAHER2 positivityrate 22 1 ASCO2009 74 HER 2与胃癌 结果显示曲妥珠单抗将中位生存期延长了2 7 13 8个月对赫赛汀的反应提高34 5 47 3 HER2高表达的肿瘤病人从赫赛汀的治疗中获益更大 75 HER 2与胃癌 2009 03 ToGA研究结果公布2010 01 EMA 欧洲药品管理局 批准胃癌适应症2010 11 FDA批准胃癌适应症2011 03 MHLW 日本厚生劳动省 批准胃癌适应症2012 08 SFDA批准胃癌适应症 76 HER2检测的重要影响因素标本的处理固定液的种类和固定时间不能检测和评估的标准试剂的选择方法的有效性结果的判读IHC和FISH报告的内容 HER 2与胃癌 77 北京肿瘤医院胃癌HER2统计 手术标本活检标本评分例数 例数 09543 26019 11 7634 511937 92 3616 48627 43 136 94915 6 Q A我院HER2检测的问题 78 Answer固定 固定 再固定 及时 及时 再及时 79 80 肺癌的免疫组化 肺癌组织病理亚型的预后和预测作用 TTF 1表面活性剂蛋白 A B NapsinA novelasparticproteinaseA CK7腺癌 p63p40HMWCK CK5 6 34 E12Desmocollin3鳞癌 81 肺低分化腺癌 肺低分化鳞状细胞癌 肺癌的免疫组化 TTF 1 CK5 6 P63 P63 82 KRAS EGFR 肺癌的驱动基因 Frequencyofmajordrivermutationsinsignalingmoleculesinlungadenocarcinomas About64 ofalladenocarcinomacasesharborsomaticdrivermutations 肺腺癌根据其基因突变的不同可以被进一步分型 开辟了基于肿瘤驱动基因的精准医学 83 EGFR与肺癌 特罗凯对于EGFR突变的肺癌患者可作为一线治疗Crizotinib对于ALK阳性的肺癌患者可作为一线治疗 84 85 虽然肿瘤的病理组织形态和临床特点与EGFR突变有关 但它们的预测价值有限 有必要进行EGFR突变的检测 因此每例肺腺癌都应该做EGFR突变检测 withtheexceptionofmucinousACa BACwhicharealwaysKRASmutants 虽然少见 但确实有粘液腺癌发生EGFR 突变 以及男性抽烟患者从治疗中获益 EGFR与肺癌 86 EGFR与肺癌 近年的研究显示EGFR突变除了作为预测标志物 可能同时还是预后的标志物 因为有突变的肺癌患者即使用常规的化疗临床预后也比较好 87 Gefitinib HR 0 19 95 CI0 13 0 26 p 0 0001No eventsM 97 73 5 No eventsM 88 96 7 Carboplatin paclitaxel HR 0 78 95 CI0 57 1 06 p 0 1103No eventsM 111 86 0 No eventsM 70 82 4 0 4 8 12 16 20 24 Timefromrandomisation months 0 0 0 2 0 4 0 6 0 8 1 0 ProbabilityofPFS GefitinibEGFRM n 132 GefitinibEGFRM n 91 Carboplatin paclitaxelEGFRM n 129 Carboplatin paclitaxelEGFRM n 85 Hazardratio 1impliesalowerriskofprogressionintheM groupthanintheM groupM mutationpositive M mutationnegativeIressaPan AsiaStudy EGFR突变与肺癌患者无病生存率 总生存期 88 Figure2Frequencyofmutationsinexons18 21oftheEGFRgeneandtheassociationwithresponsivenesstoEGFRtargetedtherapy 89 EGFR与肺癌 EGFR突变检测的方法直接测序聚合酶链反应 单链构象多态性分析PCR single strandconformationalpolymorphismanalysis高分辨率熔解扩增分析highresolution meltingampliconanalysisReal timePCREGFR突变特异的抗体免疫组化方法 90 EGFR与肺癌 无EGFR突变 EGFR21外显子突变 91 ALK与肺癌 3 13 肺腺癌患者发现有EML4 ALK基因融合最常见的融合为exons1 13ofEML4toexons20 29ofALK 至少有7种EML4 ALK融合变异EML4 ALK融合基因和产物可进一步导致RAS RAF1 MAP2K1 MAPK1通路的激活ALK 阳性患者如果接受二线或三线的crizotinib 生存率明显高于任何其他二线治疗的患者 2 yearsurvival 55vs12 但和EGFR突变不同 ALK基因的重排是预后不良标志物 92 EGFR突变特异性兔单抗隆抗体Antibody3197againstEGFRexon21L858Rmutation 95 sensitivityand99 specificityAntibody2085againsttheEGFRexon19E746 A750del 85 sensitivityand99 specificityALK融合基因特异性兔单抗隆抗体RabbitmAb 3633D5F3 均来自CellSignalingTechnologies EGFR与肺癌 93 Crizotinib 针对ALK靶点的小分子抑制剂克唑替尼 Crizotinib 是一种ATP竞争性酪氨酸激酶抑制剂 可特异性靶向抑制ALK激酶 也可抑制c MET和ROS1等信号通路 ALK与肺癌 94 ALK与肺癌 EML4 ALK融合基因检测方法双色分离荧光原位杂交方法 Dual color split apartFISH 价格昂贵RT PCR不推荐 由于福尔马林固定后组织的RNA检测失败率高需要有免疫组化的方法 95 EML4 ALKrearrangement drivermutationoflungcancer 96 ALK荧光原位杂交 阳性 分离 倒位 2p23 21 5 ALK EML4 3 倒位 70 基因融合 阴性两个信号之间的距离小于2个信号直径 12Mb 本图由LukasBubendorf提供 97 EML4 ALK检测问题 RT PCR需要做多次检测 因为可能有多种的亚型新的IHC抗体可检测ALK融合基因 rabbitmAb 363