基因组DNA分析PPT课件.ppt

基因组DNA分析 实验一高分子量DNA的提取和纯化 1 一 原理 DNA是染色体的组成成分 遗传的物质基础研究遗传 疾病发生的基础研究的前提 DNA的提取 1 破细胞 SDS破坏细胞壁2 去蛋白 苯酚 蛋白变性剂 3 除RNA RNAase 2 原理 用蛋白酶K及SDS在EDTA存在的条件下 裂解细胞 消化蛋白质 使核蛋白解聚 细胞内存在的DNA酶失活 酚 氯仿有机溶剂多次抽提以后 用透析或乙醇沉淀得到纯化的DNA 3 二 提取DNA的总原则 1 保证核酸一级结构的完整性a 防止机械剪切力损伤DNAb DNase降解DNA2 排除其它分子的污染a 样品不纯 失去抑制酶作用 有机溶剂 高浓度的金属离子 b 蛋白质 糖 脂的污染降到最低c DNA中无RNA3 保持核酸的生物学活性避免过酸过碱 4 保证高分子量DNA的完整性 影响因素 物理因素 机械剪切力 牵拉DNA损伤 对化学键破坏 DNA断裂化学因素 过酸过碱 DNA变性生物因素 DNA酶 DNA降解操作注意事项 物理因素 避免机械剪切力 钝口滴管 动作轻柔化学因素 防止过酸过碱 保证温和条件pH4 10 pH8 0 生物因素 抑制DNA酶 低温 使用EDTA 5 保证高分子量DNA的纯度 使用方法 SDS ProteinaseK EDTA 1 SDS 十二烷基磺酸纳 硫酸纳 离子型表面活性剂主要功能 1 溶解细胞膜上的脂质与蛋白质 因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜 2 解聚细胞中的组蛋白 将DNA从核蛋白上拆下来 打开二硫键 3 SDS能与蛋白质结合成为R O SO3 R Pro的复合物 使蛋白质并行而沉淀下来 故对酶有抑制作用 2 蛋白酶K 主要功能 1 蛋白水解酶活性 广谱蛋白酶 在SDS EDTA存在下保持很高的活性 2 将蛋白质降解成肽或小片段的氨基酸 3 EDTA 乙二胺四乙酸主要功能 金属离子的弱螯合剂 抑制DNase的活性 6 操作注意事项 1 为尽可能避免DNA大分子的断裂 在实验过程中必须 1 匀浆时应保持低温 冰浴中 匀浆时间应短 30s 次 2次 勿用玻璃匀浆器 2 实验中使用的吸取DNA水溶液的滴管管口需粗而短 并烧成钝口 3 苯酚 氯仿抽提时勿剧烈振摇2 保持DNA活性 避免酸 碱或其它变性因素使DNA变性3 苯酚是一种强烈的蛋白变性剂 实验时 应戴手套操作 避免碰到皮肤 以免灼伤 苯酚蒸汽毒性较大 实验中应注意将盛苯酚的试剂瓶盖好 防氧化 8 羟喹啉 4 移液枪的使用 7 实验操作 1 20 SDS25ul EDTA30ul PK20ul 8 白色絮状沉淀 PrecipitatedDNAmoleculesappearaslongpiecesoffluffy stringy web likestrands 9 实验操作 2 10 生物组织 最好新鲜组织 若不能马上提取 应贮存 70 或液氮液氮冷冻敲碎研磨组织匀浆法液氮匀浆法 三 DNA样品准备 11 酚抽提法先用蛋白酶K SDS破碎细胞 消化蛋白 然后用酚和酚 氯仿抽提 最后乙醇沉淀 获DNA大小为100 150kb 四 DNA提取 12 五 DNA的浓缩 乙醇沉淀 1 需要阳离子盐的存在NaCl对含SDS样品好 2 沉淀温度与时间0 10 15分钟 3 离心小于100bpDNA需超速离心 0 4 12000g 10分钟 13 六 DNA的鉴定 分光光度法在260nm和280nm处测定DNA溶液的光吸收 A260与A280之比应在1 7 1 80 低于此值表明制备物中留有蛋白质成份或酚 高于此值表明有RNA的残留量 14 DNA纯度鉴定 A260 A280 1 8 1 8 1 8 纯 酚或蛋白质污染 RNA污染 15 七 DNA的定量 分光光度法 测定DNA在A260nm的光吸收 计算浓度A260 稀释倍数 50 g ml 双链DNA 16 DNA浓度 g ml A260nm 50 稀释倍数 1 光径 DNA的吸收峰在260nm 1OD相当于 50 g mlDNA40 g mlRNA20 g ml寡核苷酸 17 八 DNA的贮存 1 短期贮存 4 或 20 存放于TE tris和EDTA pH8 缓冲液中 2 长期贮存 在70 乙