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陈方会 秋水仙素对菘蓝胚状体发生和染色体倍性的影响 本科毕业论文题 目 秋水仙素对菘蓝胚状体发生及染色 体倍性的影响 学 院 生命科学技术学院 专 业 生物技术(植物方向) 毕业届别 2010届 姓 名 陈方会 指导教师 王 清 职 称 教 授 甘肃农业大学教务处制 二一年六月目 录摘要. 2关键词. 2前言. 21 材料和方法. 31.1材料. 3 1.2 处理方法. 31.2.1胚状体的诱导培养. 31.2.2秋水仙素处理. 31.2.3 切片的制作及显微观察. 42 结果与分析. 42.1外源激素浓度对菘蓝叶片胚状体形成的影响. 42.2秋水仙素对菘蓝叶片外植体胚状体形成的影响. 52.3叶片胚状体的组织细胞学观察. 53 讨论. 7参考文献. 8致谢. 11秋水仙素对菘蓝胚状体发生和染色体倍性的影响再按照论文要求整理一下字体，字号就可以了。OK!陈方会(甘肃农业大学生命科学技术学院 甘肃 兰州 730070)再看看要求的论文格式，是写学院还是班级。摘 要：以菘蓝无菌苗叶片为材料，在含有不同浓度的秋水仙素及外源激素培养基上培养，研究秋水仙素对菘蓝叶片胚状体形成的影响。结果表明：菘蓝叶片产生胚状体的最佳培养基为MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 2.0mg/L。当秋水仙素浓度低于0.8%，处理时间少于9d时，秋水仙素对胚状体的发生不会产生抑制作用；当秋水仙素处理浓度达到0.8%，处理时间多于9d时，菘蓝叶片产生胚状体的频率会随处理浓度的升高和处理时间的延长而降低，叶片褐化程度加重，死亡率升高。关键词：菘蓝、秋水仙素、胚状体、叶片药用植物的多倍体育种在实践中具有重要的意义，植物染色体的加倍研究虽然已有较长的历史，但是药用植物染色体加倍的研究近些年来才受到了国内外学者的重视。据不完全统计，目前染色体加倍已在多种药用植物中获得成功，这些植物包括：黄花蒿、鬼针草、菊花脑、牛蒡、白术、芫荽、当归、川白芷、杭白芷、黄芩、丹参、南丹参、桔梗、芦荟、库拉索芦荟、药用百合、川贝母、黄花菜、红千层、生姜、芜菁、刺果甘草、黄芪、杜仲、枸杞、金荞麦、盾叶薯蓣、除以上列举的27种外，张汉明等在一篇综述中提到，在党参、宁夏枸杞、向13葵、三叉蝶豆、杂交碧冬茄、莨菪、胜红蓟、具苞罂粟、茼蒿、鹰嘴豆、牛膝、飞燕草等药用植物中也都获得成功(详细情况没有提及)。它们主要分布于伞形科，菊科，唇形科，百合科等13个科，20多个属，其中包括芦荟、当归、川贝母、鬼针草、菊花脑、黄芩等珍稀药用植物。采用的加倍试剂主要为秋水仙素，加倍用的器官与组织主要为分生组织、愈伤组织、种子等，绝大多数获得了再生植株，加倍率最高达80% ，获得的多倍体大多数为4倍体，个别为8倍体(当归)1。目前,多倍体育种已成为一种重要的新品种选育方法。与二倍体相比，多倍体植株一般具有茎秆粗壮、叶色浓绿、叶脉明显、叶片变宽，花器、果实、花粉粒和气孔增大等特征2。近几年来还发现，多倍体植株中营养成分如糖类、蛋白质及次生代谢物的含量有明显提高，如甜菊四倍体植株比二倍体植株糖苷含量提高了4.9%3；粗根类丹参多倍体品系产量高于二倍体品系产量，但活性成分（丹参酮）产量反而减少，而丛根类丹参多倍体品系与二倍体丹参相比，不仅产量增加，丹参酮的含量也能提高79% 4。裴新膨等还报道，多倍体植物对外界环境的适应性较强，表现出较强的抗寒、抗旱、抗病等抗逆性，因为多倍体植株中基因序列的增加提高了基因功能的保险性，为逆境条件下的生存与竞争提供了稳定的遗传基础5。但对于中药材而言,多倍体以其巨大性和有效成分含量高而备受育种学家和消费者关注。然而,在自然条件下多倍体的发生率很低,且所需时间漫长,进行人工诱导和选育多倍体则可以克服这些不足。利用秋水仙素直接诱导种子或在培养基中添加秋水仙素诱导多倍体,是目前诱导植物四倍体常用的方法 6。菘蓝(Isatis indigotica Fort.)是我国的一种常用中药材。全株均可入药，其根商品名称板蓝根，具有清热、凉血、解毒的功能。其叶称为大青叶，内含靛蓝和靛玉红，近年来发现靛玉红有治疗白血病的作用7。目前,诱导菘蓝四倍体的各种方法均处在研究和探索阶段,生产上还没有一个大面积推广的四倍体菘蓝新品种,利用秋水仙素诱导菘蓝四倍体,值得进一步研究。本文通过秋水仙素对菘蓝叶片诱导处理,目的在于筛选出一种最适于菘蓝叶片产生胚状体的外源激素配比和秋水仙素诱导菘蓝多倍体的最适浓度及处理时间,为今后人工诱导菘蓝多倍体提供研究基础。1 材料和方法1.1材料 菘蓝种子（甘肃农业大学生命科学技术学院遗传实验室提供）先用自来水冲30min,再用0.1%的HgCl2处理10min,最后用无菌水冲洗34次，无菌条件下接种到MS基本培养基中进行培养得到无菌苗，然后取无菌苗的叶片进行培养。1.2处理方法1.2.1 胚状体的诱导培养 选择长势好，颜色深绿的崧蓝无菌苗叶片，剪成约0.3cm2 的小块接种于以下含不同浓度激素的MS培养基中，每个浓度5个重复。CK ：MS + 6-BA 0.1 mg/L + NAA 0.1mg/L；1）MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.2mg/L；2）MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 2.0mg/L；3）MS + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 1.0mg/L；4）MS + 6-BA 1.0 mg/L + 2,4-D 1.0mg/L；5）MS + 6-BA 2.0 mg/L + 2,4-D 2.0mg/L。在25、不间断光照条件下培养。1.2.2秋水仙素处理 将生长旺盛的崧蓝无菌苗叶片去叶缘剪成0.3cm2小块分别接种于含不同浓度秋水仙素（0、0.2%、0.5%、0.8%、1.0%）的培养基中，每个浓度3个重复，每瓶处理接入约10个外植体，进行愈伤组织的诱导及分化，秋水仙素处理1d、3d、5d、9d、12d、15d、20d时将正在培养的生长较好的外植体从培养基中取出，移入不含秋水仙素的培养基（MS+ 6-BA 2.0 mg/L+ NAA 2.0mg/L）中进行分化培养。观察统计不同秋水仙素下菘蓝叶片外植体胚状体发生的频率。结果统计：胚状体频率(%)=产生胚状体叶片数/接入的叶片数100 褐化频率(%)=褐化叶片数/接入的叶片数1001.2.3切片制作及显微观察 取不同秋水仙素浓度和不同处理时间下生长状态良好的外植体，FAA固定液固定24h后进行石蜡切片的制作，番红固绿复染法染色后，于40物镜40数码显微镜下观察菘蓝叶片外植体的细胞形态变化8。2 结果与分析2.1外源激素浓度对菘蓝叶片胚状体形成的影响叶片外植体置于诱导培养基中进行培养,一般3d左右开始膨大，7d后叶片边缘向叶远轴面卷曲,叶片膨大明显,有少量愈伤组织出现，10d左右部分叶片外植体露出芽点,胚状体出现的高峰期在接种后的28 32d。多数胚状体的形成不经历愈伤组织阶段,直接从培养的叶片外植体上分化产生, 且胚状体产生位点主要在叶片的切口部位。培养30d左右，外植体中有少量根的分化。不同激素配比及不同浓度的激素对菘蓝叶片产生胚状体的频率具有显著的效应, NAA与6-BA组合能够有效诱导菘蓝叶片胚状体的形成，并随着两者浓度的升高胚状体频率有逐渐增加的趋势，并于2.0mg/L NAA、2.0mg/L 6-BA时胚状体频率最高（58.57%）。而2, 4-D和6-BA的组合能够很好的诱导愈伤组织产生,但最终没有分化出胚状体。另外，在含有2，4-D的培养基中，菘蓝外植体更易褐化，且在1mg/L 2，4-D+1mg/L 6-BA时褐化频率最高，达到63.71%（表1）。表1. 外源激素对菘蓝叶片胚状体诱导频率及褐化频率的影响Table 1 The effect of hormone induction frequency and browning frequency on embryogenesis of Isatis indigotica Fort leaves外源激素胚状体诱导率（%）褐化率（%）NAA2,4-D6-BA4月10号4月14号4月17号4月10号4月14号4月17号0.2 2.0 12.36 26.87 30.66 0 0 0 2.0 2.0 23.46 47.14 58.57 0 1.67 1.67 1.0 1.0 19.63 33.21 50.71 0 0 9.52 1.0 1.0 0 0 0 21.15 40.38 63.71 2.0 2.0 0 0 0 15.67 21.92 47.77 0.1 0.1 0 0 0 0 0 0 可见，当添加 6-BA 2.0 mg/L，NAA 2.0mg/L的MS培养基最适于菘蓝叶片形成胚状体。2.2秋水仙素对菘蓝叶片外植体胚状体形成的影响秋水仙素的处理浓度和处理时间直接影响叶片形成胚状体的频率（结果见表2）。当秋水仙素浓度为0.2%时，即便秋水仙素处理15d，仍然能够获得100%的胚状体频率，并与对照无差异。随着秋水仙素浓度的升高，处理时间的延长，胚状体频率有逐渐下降的趋势，但在0.20.8浓度范围，处理时间以内时，胚状体的发生频率仍能达到60%以上，说明此浓度、处理时间范围内秋水仙素对叶片的毒害作用相对较小；当秋水仙素浓度高于0.8，处理时间多于天时，大量叶片外植体褐化死亡，胚状体的发生频率明显降低。表2 秋水仙素处理对胚状体形成频率的影响Table 2 the effect of colchicine treatment on the embryoids producing frequency处理时间秋水仙素浓度（%）CK0.20.50.811d100%100%100%91.76%90.91%3d100%100%100%63.64%100%5d100%100%100%100%90%9d100%100%80%100%60%12d100%100%100%70.00%55.56%15d100%100%100%66.67%66.67%20d90%66.67%80%22.22%11.11%2.3 叶片胚状体的组织细胞学观察 对制作的一系列石蜡切片通过数码显微镜观察（图2）。发现接入诱导培养基1d和3d的叶片组织细胞排列紧密有序，具一定的规律性，说明细胞还未启动分裂。5d的组织表面略有凸起，细胞形状不规则，呈多边形；细胞之间虽紧密连接，但排列无序。从第9天开始，组织表面可以看到明显的凸起，细胞中出现一些分生细胞团，染色较周围深，细胞排列紧密，核仁明显，占细胞比例大，表明这些细胞已经脱分化进入了分裂期910。可见，菘蓝叶片外植体在接入诱导培养基5天时，细胞开始启动分裂。 1d 3d 5d 9d 12d 15d 20d 图2 石蜡切片的显微观察 Fig.2 Microscopic observation of paraffin sections注：在20d的切片中可以看到很多分散的染色较深的细胞团，这可能就是今后将形成胚状体的原始细胞。3 讨论 （1）进行菘蓝的组织培养，可以直接诱导胚状体，亦可先诱导愈伤组织，再诱导分化生成胚状体。6-BA和NAA对菘蓝叶片分化均有一定的促进作用，在所设范围内，2种激素都以稍高浓度的效果较好，5种激素浓度配比中叶片分化效果最好的培养基为MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 2.0mg/L。2,4-D能够诱导愈伤组织。菘蓝叶片诱导愈伤组织宜采用MS+6- BA 1.0 mg/L+ 2,4-D 1.0mg/L培养基1113。（2）利用秋水仙素进行染色体加倍具有经济、方便、诱变作用、专一性强等特点。近年来，关于离体组织水平上利用秋水仙素诱导染色体加倍的研究越来越多，不同材料对秋水仙素的敏感性存在差异；而对于同一种材料，秋水仙素浓度和处理时间也会影响加倍效果。因此，选择合适的浓度和处理时间对诱导染色体加倍至关重要。在本试验中秋水仙素处理菘蓝叶片时，秋水仙素溶液的浓度和处理时间的较好组合是秋水仙素浓度为0.8%、处理时间为9d。但本试验还缺乏对不同材料或不同处理方法的比较，因而对于秋水仙素处理浓度和时间最佳组合的规律还有待进一步探索。秋水仙素有剧毒，不仅能使外植体受害，明显抑制不定芽分化，再生植株生长缓慢，而且可使外植体在继代过程中褐化死亡，其毒害程度往往随着处理浓度的增加和处理时间的延长而加剧。本试验结果表明，随着秋水仙素浓度的增加，外植体的褐化程度呈上升趋势；同一浓度下，随着处理时间的延长外植体受害程度也加重。所以，秋水仙素的浓度和处理时间共同影响着外植体的成活率及其诱导效果，秋水仙素浓度高、处理时间长，常使多倍体诱导率升高，但材料死亡率也高；而低浓度，短时间处理，则不易获得加倍材料。一般认为，对具体材料而言，浓度高时，处理时间要短；浓度低，处理时间长。因此，掌握合适的秋水仙素处理浓度和时间对获得较好的加倍效果极其重要14。（3）越来越多的资料显示，虽然秋水仙素等这类以纺锤体为生物学作用终点的诱变剂对细胞的毒性和遗传的毒性不及那些以损伤DNA和染色体为生物学作用终点的诱变剂所造成的伤害明显，但这并不意味着秋水仙素等这类纺锤体毒物(SP)只在染色体数目上引起异常而未对染色体结构造成影响15。有资料证明：苯二酚有明显的染色体结构畸变效应，关于纺锤体毒物对染色体结构的伤害用目前的技术水平无法检测到或者未受到足够的重视。所以，秋水仙素诱变对染色体畸变效应的影响还有待于进一步探索。另外，秋水仙素诱变浓度及处理时间不同也会对植株造成不同程度的伤害。（4）秋水仙素能引起细胞超微结构和亚显微结构的变化，使细胞形态发生不可逆变化，导致分生细胞从胚性转向分化，引起胚胎发生能力丧失，具有分化细胞特征。Hayashi用秋水仙素诱导胡萝卜的单细胞胚胎发生率低于无秋水仙素处理的团聚细胞。关于细胞核的变化，丛斌用秋水仙素处理小麦根尖，发现核占细胞体积的比例减少，形态变化多样，且其形态变化与秋水仙素起作用时细胞分裂所处的状态有关。参考文献:1 武振华，牛炳韬，王新宇.药用植物染色体加倍的研究进展M .中国科技大学出版社，2000，9（1）：911.2 ZHANG X C,LIANG G L,YAN Y,et al Rapid propagation and polyploid induction of aloe J. Chinese Agricultural Science Bulletin,2004,20(3):33-35（in Chinese）3 薛建平，柳俊，蒋细旺，等.药用植物生物技术M .中国科技大学出版社，2005：191193.4 ZHU D N,GAO SH L,CAI ZH H,et al Comparison of three kinds tanshinone content in polyploid lines of SalviamiltiorrhizaJ.Pharmaceutical Biotechnology,1996,3(1):22(in Chinese).5 王莉. 菘蓝叶片组织培养分化成苗J. 植物生理学通讯，1985,（02）6 陈柏君，高山林，卞云云. 黄芩组织培养同源四倍体的诱导 J . 植物资源与环境学报，2000，9（1）：911.7 苟克俭, 任茜. 菘蓝叶片离体培养成苗J. 中药材，1991，（06）.8 李正理.植物制片技术M.北京：科学出版社，1991（第二版）.119.9 客绍英，张胜珍，郭月霞. 菘蓝组培过程中细胞组织学观察J. 唐山师范学院学报，2006，（02）.10 曾建军，孙一铭，孙敏，等. 菘蓝离体培养过程中愈伤组织和再生芽发生的细胞组织学观察J. 西南师范大学学报（自然科学版）2006，（04）.11 张丽琼，周琼，柳林，等.不同培养基对菘蓝叶片组织培养的效应J . 广西热带农业，2007（6）：3031.12 周哓丽，冯奇志，奚春荣. 菘蓝的丛生芽诱导及快速繁殖J. 植物生理学通讯， 1991，(01).13 KHOSRAVI P ,KERMANI MJ ,NEMATZADEH GA, et al. Role of mitotic in hibitors and genotype on chromosome doubling of Rosa J . 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