实验肿瘤学PPT课件.ppt

实验肿瘤学基本概念 1 肿瘤发生发展的一般过程 正常细胞癌细胞原位癌浸润癌转移癌休眠预防诊断治疗 2 肿瘤细胞的生物学特点 自我满足的生长信号对生长抑制信号不敏感逃避凋亡无限增殖的潜能血管生成浸润和转移 3 实验肿瘤模型的要求 忠实地重现人类肿瘤的生物学特性 4 实验肿瘤学的研究方法 5 直接研究建立细胞系建立动物模型 6 细胞系的基本概念 组织培养和细胞培养 模拟体内环境在体外培养机体组织和细胞 使之生存和生长 原代培养 primaryculture 从体内取出组织和细胞的第一次培养 传代 passage 细胞长满培养瓶后 细胞分成2 3瓶继续培养 细胞系 cellline 原代培养细胞首次传代成功后的细胞 称细胞系 Finitecellline continuouscellline establishedcellline细胞株 cellstrain 通过选择或克隆 从亲代细胞系选出的带有特定标志的细胞群 瘤株 在动物体内可传代的肿瘤细胞系 ATCCAmericanTypeCultureCollection美国模式培养物收集中心 美国菌种保存中心 7 培养细胞的生长方式 贴附生长型细胞 细胞附着于支持物表面生长 上皮细胞型 来源于外胚层和内胚层的细胞 细胞为扁平多角形 细胞之间紧密相靠成片 成纤维细胞型 来源于中胚层的细胞 细胞呈梭形 排列成漩状 放射状 栅栏状 悬浮生长型 造血系统的细胞 8 培养细胞的生长特点 贴附生长 支持物可为玻璃 塑料 胶原 其他细胞等 停泊或贴壁依赖性细胞 anchorage dependentcell 接触抑制 contactinhibition 正常细胞相互接触后 细胞将向另一个方向移动 从而使细胞不会重叠生长 密度抑制 densityinhibition 正常细胞汇合成片后细胞分裂停止 在静止状态下细胞存活一段时间汇合confluent 9 培养条件 基本营养成分RPMI1640DMEM DulbeccosmodifiedEaglemedium 谷氨酰胺生长因子小牛血清胎牛血清灭活补体56 30min环境37 pH7 2 7 4渗透压无污染无毒细菌 支原体 10 体外培养的优点 优点 1 活细胞 2 对象均匀 易控制实验条件 易于观察和纪录实验结果3 易研究单个细胞的结构和功能 易于进行分子生物学水平研究 4 实验周期短 成本低 细胞系可长期保存 11 体外培养的缺点 1 在体外细胞生物学行为与在体内不完全一样 G1G0终末分化肿瘤细胞MS介质细胞G2 12 2 转化 transformation 在体外培养过程中细胞的遗传性状发生变化 分为一般转化和恶性转化 一般转化 指细胞获得不死性 恶性转化 指出现在软琼脂培养基中浸润生长 在动物体内成瘤 血清依赖性降低 生长密度依赖性降低 3 体外实验结果不能外推到体内实验 13 细胞培养的应用 研究细胞与环境的相互作用细胞间的相互作用细胞内胞质活动细胞质与细胞核之间的流动 14 建立细胞系的基本要求 细胞在体外培养半年以上 生长稳定 保持细胞特征并能传代 15 建系方法 1 原代培养 无菌操作 取肿瘤组织 切成小片 小于0 5毫米 进行培养 或用胰酶 胶原酶消化成单细胞悬液 血清灭活酶 培养2 传代 待细胞长满培养瓶 胰酶消化 按1 2 3传代3 去除杂细胞4 冻存细胞10 DMFO 90 胎牛血清 4 30min 20 2hrs 70 过夜 液氮 长期保存 登记 定期复苏细胞 复苏 37 水浴 加培养基洗一次 培养5 鉴定 16 鉴定 细胞形态观察癌细胞多角型 重叠生长 核浆比例失调 多核巨细胞染色体分析数量和核型 核带 标记染色体细胞生长曲线和细胞周期集落形成率动物接种成瘤 组织形态学与原发肿瘤相似污染无病毒 支原体污染 细胞间交叉污染Helacell 1951年HenriettaLack宫颈癌 17 实验动物基础知识 18 法规 1988年中华人民共和国实验动物管理条例1989年医学实验动物管理实施细则1994年关于在全国医疗卫生系统实行实验动物合格证制度得通知 医学实验动物合格证书 医学实验动物环境设施合格证书 医学实验动物全价营养饲料合格证书 医学实验动物饲料生产条件合格证书 1988年广东省实验动物管理办法 19 基本概念 实验动物 laboratoryanimal 指人工培育的 对其携带微生物实行控制 来源清楚 遗传背景清晰 可用于科学实验的动物 实验用动物 animalforresearch 能用于科学实验的动物 包括实验动物 野生动物 经济动物和观赏动物 标准化实验动物 有明确的遗传背景 繁殖方法 饲养环境 饲料成分均达到标准的实验动物 在科学研究中必须使用标准化实验动物 20 实验动物的分类 遗传背景 近交系 纯系 连续20代以上兄妹交配或亲子交配而获得的遗传上达到一致的动物群 如BLAB c小鼠 杂交群 两个近交系动物间有计划进行交配获得的第一代动物 封闭群 由同一血缘品系进行自由交配 在固定场所保存繁殖5年以上得动物群 如Wistar大鼠 SD大鼠 突变系 正常染色体基因突变导致遗传缺陷的动物 如裸鼠 21 按微生物控制分类 一级 普通动物 不携带人畜共患疾病病原体的动物 二级 清洁动物 不携带人畜共患疾病病原体和动物传染病病原体的动物 三级 无特定病原体的动物 specificpathogenfree SPF 动物体内不存在特定病原微生物和寄生虫的实验动物 四级 无菌动物 不存在微生物和寄生虫的实验动物 一级动物只能用于教学和某些研究的预实验 卫生部以上课题和研究生课题必须使用二级以上动物 22 免疫缺陷动物 23 裸小鼠 nudemice 1962年英国发现 鼠11号染色体裸基因nu是隐性突变基因 裸基因纯合子 nu nu 鼠的特征 1 全身无毛 裸体外表 2 胸腺上皮细胞不能增殖 T细胞发育受阻 T细胞免疫缺陷 3 B细胞形态正常 功能较差 免疫球蛋白以IgM为主 少量IgG 类似于人原发细胞免疫缺陷 随着鼠龄增加 T细胞增加 移植实验一般用4 8周鼠 4 裸小鼠抵抗力差 易患病毒性肝炎和肺炎 应饲养在SPF环境 5 纯合型雌鼠不能生育 nu 和 nu nu交配可获1 2纯合子鼠 常用BALB cnu nu Swissnu nu NCnu nu 24 应用 建立人肿瘤的裸鼠移植瘤模型研究致癌机理 1 在裸鼠体内诱发人类肿瘤 EBV2 生物因素的致瘤性 多瘤病毒只在新生鼠或幼鼠诱发肿瘤 而在成年裸鼠也可在远离注射部位诱发肿瘤 在雌鼠为乳腺癌 雄鼠为骨肉瘤 25 裸大鼠 nuderat 1953年苏格兰在远交系hooded大鼠中发现 因饲养不当而绝种 1975年重新发现纯合子大鼠 纯合子rnu rnu鼠无胸腺 缺乏功能性T细胞 抵抗力低下 26 严重联合免疫缺陷鼠 severecombinedimmunedeficiencymice SCID 1982年美国发现于C B 17 ICR品系 Scid位于16号染色体 是隐性突变基因 纯合子scid scidT细胞和B细胞功能缺陷 血清中无免疫球蛋白 外周血淋巴细胞数量明显减少 NK细胞功能正常 接受单克隆抗体杂交瘤移植后易形成腹水瘤 可获得高纯度的单克隆抗体 SCID鼠被毛发正常 雌雄可生育 27 动物肿瘤模型 28 自发肿瘤 动物自然发生的肿瘤 发病过程与人类肿瘤相似 但发病时间早晚不一 不易在短期内得到实验结果 29 诱发肿瘤 用化学 物理 生物等因素在动物体内诱发的肿瘤 物理 生物因素诱发肿瘤的潜伏期长 发生率不稳定 常用化学因子诱发肿瘤 常用于肿瘤病因 化学预防的研究 30 诱发肿瘤模型的基本要求 简单易行 易重复选择对特定致癌物敏感的动物种系 多环芳香烃 皮肤 小鼠 甲基卞肼亚硝胺 食道癌 大鼠 甲基氨基偶氮苯 肝癌 大鼠恰当的致癌物剂量 动物存活率高 诱发周期短 诱发的肿瘤类似于人类肿瘤 31 原位诱发 如 0 25 二已基亚硝胺0 25 1ml灌胃 6月 70 发生肝癌异位诱发 将与致癌物作用过的器官或组织移植于自体或同系 同基因正常动物皮下 诱发所需的肿瘤 如 甲基胆蒽穿线法穿入幼鼠子宫颈 将子宫颈切除 移植于同系成年小鼠皮下 3个月后诱发异位子宫颈癌 32 可移植性肿瘤肿瘤组织在同种或异种动物体内传代后获得的生物学特性学相对稳定的肿瘤 33 同种可移植性肿瘤可分为实体瘤 腹水瘤 淋巴瘤 白血病到1997年我国65株 腹水瘤 将可移植性实体瘤接种于同种动物腹腔或腹壁 待肿瘤生长后形成腹水 再接接种于同系肿瘤 用于药物筛选 异种可移植性瘤 免疫力正常动物 免疫隔离区如眼前房 脑内 或免疫抑制 如X线照射 可的松免疫缺陷动物 34 移植部位 原位移植 orthotopicimplantation 异位移植 ectopicimplantation 皮下 肾包膜下 腹腔 35 可移植性肿瘤的参考标准 传15 20代以上接种成活率100 自发消退率 5 生长速度稳定 宿主寿命稳定 宿主反应低下瘤组织的组织结构与原发瘤相似 保持原发瘤的特性和标志 36 肿瘤转移的基本过程 原发灶血管生成 降解细胞外基质癌细胞入血 淋巴管癌细胞穿过管壁细胞增殖 休眠再次转移机理 种子与土壤 37 侵袭模型 背侧品皮下移植侵袭模型肌肉内移植侵袭模型腹腔内移植侵袭模型肾包膜下移植侵袭模型睾丸包膜下移植侵袭模型爪垫皮下移植侵袭模型小鼠尾部移植侵袭模型耳廓皮下移植侵袭模型癌细胞侵袭视网膜内界膜侵袭模型 38 转移模型 自发转移模型 spontaneousmetastasis 肿瘤细胞穿过宿主自然屏障 侵入血道和淋巴道而发生的转移 常用同种移植瘤和人肿瘤原位移植瘤 后者反映人肿瘤细胞与宿主器官的相互作用 可用于辅助治疗的研究实验性转移模型 experimentalmetastasis 人工方法将癌细胞移植于血道和淋巴道而发生的转移SCID Hu鼠模型 将人胚器官如肺 骨髓等移植于SCID鼠皮下 建立癌细胞对靶器官的移植模型 39 血管生成研究模型 1 人肿瘤组织肿瘤微血管密度iMVD生长因子2 移植瘤3 血管内皮细胞系4 MatrixImplant5 CAM血管生成有种属特异性 40 肿瘤休眠 tumordormancy 肿瘤细胞在机体内持续存在而又没有明显生长 2年 的状态 此时肿瘤细胞处于G0期或增殖和凋亡相平衡 微小转移灶 micro metastasis 在原发灶以外用常规临床检查方法不能发现的肿瘤病灶微小残留灶 治疗后在原发灶遗留的小量肿瘤细胞 41 转基因动物肿瘤模型 理论基础 1肿瘤是癌基因突变 抑癌基因失活的结果2基因功能在进化中是保守的 42 转基因动物 外源基因在动物染色体稳定整合并遗传给后代的动物 用途 生物医药基因表达调控单基因表达调控多基因表达调控基因敲除 knockout 43 转基因方法 DNA逆转录病毒 DNA转染胚胎干细胞显微注射受精卵四细胞胚胎囊胚原肠胚转基因动物显微注射逆转录病毒DNADNA 44 纤维注射与逆转录病毒转染的比较 转基因方式显微注射逆转录病毒转染DNA导入 50kb 单细胞受精卵 10 15kb 4 6细胞卵培养液M16高营养液移卵输卵管子宫整合随机整合 多拷贝随机整合 嵌合体 单拷贝表达受旁侧序列影响受病毒LTR影响 在一定范围内表达水平易缺失与拷贝数成正比传代可传代整合至生殖细胞的可传代 45 显微注射法建立转基