胶内酶解.doc

一、 试剂准备130mmol/L K3Fe(CN)6 铁氰化钾9.9 mg K3Fe(CN)6溶于1mL Milli-Q水2100mmol/L Na2S2O3 硫代硫酸钠 24.8 mg Na2S2O3溶于1mL Milli-Q水3200mmol/L NH4HCO3 碳酸氢铵 0.079g NH4HCO3溶于5 mL Milli-Q水4. 覆盖液 （酶解缓冲液） 40mmol/L NH4HCO3, 10% ACN 200ul 200mmol/L NH4HCO3, 100ul ACN, 700ul Milli-Q水5. 萃取液 50 ACN，0.1% TFA6. 胰蛋白酶贮存液：胰蛋白酶溶于50mM醋酸溶液中（1mL Milli-Q水加入冰醋酸2.86 uL），浓度1ug/uL，即每管20ug，溶于20uL 50mM醋酸溶液中。 工作液：使用覆盖液稀释至10ng/uL7. 脱色液 银染脱色液：30mmol/L K3Fe(CN)6与100mmol/L Na2S2O3 1:1混合 考染脱色液：50 ACN, 40mmol/L NH4HCO3 以上试剂单独存放在质谱准备室，不要使用其他来源的药品、试剂，其中脱色液需现用现配。二、 实验步骤1. 切胶用剪刀剪断Tip（进口Tip），将蛋白质斑点从凝胶上切下，置于0.5 mL EP管内（进口产品），每管加Milli-Q水400 uL振荡洗涤2min，吸出液体后重复一次，以保证酸液被洗净。2. 脱色银染样品：每管加入现配脱色液50-80uL（视胶粒大小而定），静置2min左右，当胶粒由棕黑色变成亮黄色（与脱色液颜色相同时），迅速加入400uL Milli-Q水终止反应，重新加入400uL Milli-Q水振荡洗涤一次，吸出多余的液体。（3H2O2/25mM NH4HCO3/H2O）考染样品：每管加入现配脱色液50-80uL（视胶粒大小而定），静置2min左右，待胶粒蓝色褪却时，加入400uL Milli-Q水终止反应，重新加入400uL Milli-Q水振荡洗涤一次，吸出多余的液体。3. 洗涤向每管加入200uL 40mmol/L NH4HCO3，振荡洗涤2min，多余液体吸出丢弃，重复1次。 4. 脱水向每管中加入100-150 uL 纯ACN，振荡脱水，待胶粒变白后，将CAN吸出舍弃，将装有胶粒的离心管开盖置于真空干燥箱或真空浓缩仪中干燥处理10min。 5. 酶解 a) 根据胶粒大小，加入合适体积的胰蛋白酶工作液（浓度10ng/uL），以完全盖住胶粒为准，冰浴45min，使胶粒充分吸收酶解液并溶涨。b) 将管内多余的酶解液吸出舍弃，加入20-40uL覆盖液（以完全盖住胶粒为准），倒置放在37度烘箱中孵育过夜（12-16小时）。 6. 肽段抽提 次日，吸出管内酶解溶液，置于另一0.5 ML EP管中，在装胶粒的原EP管中加入萃取液20uL, 振荡洗涤20min，吸取液体与第一次吸取的液体合并，再次加入萃取液20uL, 振荡洗涤10min，并超声5min，吸取液体与前两次合并。 7. 离心 将新管内三次萃取的液体于离心机内10000rpm离心5min，吸取上层溶液转移至新的EP管内，注意不要吸取底部可能存在的微小胶粒沉淀。 8. 真空干燥 将装有抽提液的离心管开口置于真空干燥机内浓缩抽干，约需3h左右，再加入0.1%的TFA水溶液复溶，置于20度冻存待用于质谱鉴定。三、 注意事项1. 操作过程中必须带手套、口罩2. 使用干净新鲜的溶液，不能有杂质和混浊物3. 酶解在干净无尘环境下操作4. 注意离心管，枪头干净，全部使用进口产品5. 每次实验设置一个空白对照（从胶上无点位置去一块胶粒同时实验）和污染控制对照（使用无样品的空离心管，操作同于样品处理）如何看明白和分析质谱测试报告？这是一个每次都被问到的问题，所以在这里贴上测试报告的截图和截图说明，希望对大家有所帮助。一、报告标题（Analysis Information）1 Report Type:说明样品是Gel based模式（2D胶）或LC based（LC-MS），可不用深究。2 Analysis Type:说明分析类型，有三种：MS(仅分析一级肽指纹质量)；MS/MS（仅分析所有二级肽碎片质量）；Combined MS+MS/MS（一级肽指纹质量与二级肽碎片质量综合分析）,一般来说，2D胶或PAGE胶来源的样品使用Combined MS+MS/MS，LC分离肽段的Shotgun proteomics策略则为MS/MS。分析类型在论文中要加上。3 Sample set name: 没意义，可不看。4 Database: 搜库使用的数据库（截图中是NCBInr），在撰写论文时要说明使用的数据库名称。5 Analysis Name、Creation Date、Reported By、Last Modified等其他信息: 没意义，可不看。二、报告正文表头（灰色阴影部分）1 Gel idx/pos：指质谱靶的顺序编号（数字）和坐标位置（字母数字），说明你的样品在质谱靶上的位置信息，一般测试结束会拿到测试报告，测试报告表将样品编号和靶点编号已经填写对应，请注意核对。2 Instr./Gel Origin：仪器编号和spot set名称，没意义，可不看。3 Process Status、Plate name、Instrument Sample name、spectra:没实际意义，可不看。三、鉴定信息说明（灰色阴影表头以下部分，重要！）灰色阴影表头下有一排加粗的标题，例如Rank,protein name等，这时鉴定结果的标题，具体说明如下：1 Rank：在Rank目录下可看到1、2、3、4等编号，需要说明的是，质谱鉴定是通过相似性比对得到蛋白质信息的，数字代表的是这种相似性的先后排序。（至于如何判断哪一个是目标蛋白，后面会说到）2 Protein Name: 蛋白质名称，一般会在名称后带上物种分类名称（拉丁字符）3 Accession No. 上述蛋白质对应数据库的登录号，可在NCBI网站上输入该号查找蛋白质或基因完整序列（同理，如过搜库使用的是Uniprot数据库，则在Swiss-prot上查找）。如使用自建数据库，请用Windows自带的写字板打开FASTA格式的数据库，查找蛋白质序列。4 Protein MW:该蛋白质的理论分子量（一般根据氨基酸序列计算，注意，这里是理论分子量，有可能与真实相差很大！）5 Protein PI:该蛋白质的理论等电点（同上，属于理论值，同你的2D胶图上点的位置可能偏差十万八千里！）6 Pep Count:质谱打出的所有肽段质量中，能与上述蛋白质的肽段中匹配的数量，这个值体现了肽段的覆盖率（当然越高越好！）这里说明一下搜库的原理。一般我们使用胰蛋白酶酶解蛋白质（切赖氨酸位点），在搜库时，电脑会对数据库中的所有蛋白质序列进行一次胰蛋白酶的理论酶解，得到海量的酶解肽段（理论上的），将质谱数据与这些理论值比对，达到鉴定蛋白质的目的。7 Protein score、Protein Score CI%：这两个数值是最重要的数据！一般来说，Score大于60，CI%大于95被认为是成功鉴定的阈值。在MASCOT算法中，它们代表的意思是得分值和得到这个分值的统计学可靠程度（CI），解释起来比较复杂，但记住60和95这两个值就行了。特殊情况下，会出现得分和置信度低于上述值得情况，如果低得不多也可认为鉴定成功，如果低得多就不靠谱了！至于如何判断多少，自己结合研究背景琢磨吧。8 Total ion score、Total ion CI%:在Shotgun proteomics策略中分析所有MS/MS离子得分和置信度，意义不大，可不用理会。9 protein group：有些报告中会出现，特别是鉴定得到得蛋白质是unname，说明该蛋白质属于某一个蛋白质家族之类的意思，有一定的参考意义。10 Peptide information: Calc Mass(理论值)；Obsrv. Mass(观测值，质谱采集到的真实值)；Da（理论值和观测值的偏差）；ppm（百万分之偏差率）；Start Seq/End Seq(起始序列位置和结束序列位置)；Sequence(完全匹配上的肽段序列)；Ion Score/CI%(该肽段的相对于整个蛋白质的得分和置信度，特别低的得分会隐藏，可不看)；Modification(修饰，非常重要，需要检测蛋白质修饰的情况必须看位点修饰情况，一般我们设置可变修