人源化抗体的制备PPT课件.pptx

制备针对某种肿瘤抗原并应用于临床治疗的人源化抗体 2020 1 4 1 4月刊 自然综述癌症 Nature Reviews Cancer Antibodytherapyofcancer 概述了开发癌症患者抗体治疗的基本策略及发展状况 2020 1 4 2 抗体在杀伤肿瘤中的作用 2020 1 4 3 治疗性单抗识别的肿瘤相关抗原分类 造血细胞分化抗原 细胞表面分化抗原 糖脂 糖蛋白 碳水化合物 参与生长和分化信号的抗原 作为治疗靶标的间质和细胞外基质抗原 参与血管生成的抗原 2020 1 4 4 自1997年至今 共有12种抗体获得了FDA 美国食品药品管理局 的批准用于治疗各种实体瘤和血液系统恶性肿瘤 2020 1 4 5 寻找靶向抗原 基本要求 2020 1 4 6 寻找靶向抗原 不同功能 2020 1 4 7 寻找靶向抗原 应对逃逸机制 2020 1 4 8 为什么要制备人源化抗体 鼠源单克隆抗体 神奇的子弹 2020 1 4 9 单克隆抗体的若干缺陷人抗鼠抗体Humanantigenmouseantibody HAMA 不能有效激活人体中补体和受体相关的效应系统体内半衰期较短 2020 1 4 10 人源化抗体优点 减少降低了机体的免疫排斥反应募集效应因子或效应细胞在体内的半衰期长 对于该现象的解释是 人源化抗体中的Fc段可以特异结合人血管内皮细胞上的Fc受体 FcRn 使抗体内化到血管内皮细胞而不被降解 并能够回到血液中参与循环 鼠抗体由于不能有效的与人FcRn结合而很快从循环系统中清除 2020 1 4 11 抗体人源化的基本原则 保持或提高抗体的亲和力和特异性大大降低或基本消除抗体的免疫原性 所以 构建人源化抗体的关键在于选择合适的人抗体轻链和重链作为鼠cDRs的框架区 2020 1 4 12 2020 1 4 13 鼠单抗人源化 将小鼠Ig基因敲除 转染人Ig基因 在小鼠体内产生人Ab 再经杂交瘤技术 产生大量完全人源化抗体恒定区人源化 人 鼠嵌合抗体可变区人源化 人改型抗体用抗体库技术进行人源化 2020 1 4 14 鼠单抗人源化 2020 1 4 15 鼠抗体 红 和人源化抗体 绿 Fv结构的叠合图 表面氨基酸残基人源化 2020 1 4 16 方法步骤 获得鼠源单抗重轻链可变区基因可变区基因定点突变构建人鼠嵌合基因构建真核表达系统 2020 1 4 17 1 获得鼠单抗重轻链可变区的基因片段 肿瘤抗原免疫小鼠 取小鼠脾细胞 含B细胞 骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞株 分别获得抗体VH VL基因 PEG RT PCR 设计引物 参照发表的该鼠源单抗重轻链可变区基因 2020 1 4 18 2 重轻链可变区基因片段分别连接克隆载体 获得的两个可变区基因 酶切 连接 克隆载体 转化 原核表达系统检测 抽质粒 测序鉴定 2020 1 4 19 第一代人源化抗体 人鼠嵌合抗体 2020 1 4 20 CDR序列 CDR序列 鼠单克隆抗体 人抗体 人源化抗体 2020 1 4 21 在选择人FR时一般有两条途径 起初的一条是 根据已有晶体结构数据的人源抗体的可变区框架 借助序列比较与分子模建确定在人 鼠间的种源差异 由其是鼠FR中与CDR有密切作用的氨基酸残基 要保留在替换的人源FR中 第二条途径是 在已有的抗体序列库中搜寻与鼠单克隆抗体FR有最大同源性的人源FR用以替换 在选择同源的人FR时 先前倡导将VL和VH作为一个整体来考虑 寻找最高同源的人FR 后来则认为 将VL和VH分开考虑 分别寻找最高同源的对应序列 2020 1 4 22 3 鼠源可变区编码基因进行PCR定点突变 根据突变位点设计引物进行多轮突变 获得重塑的鼠源可变区基因质粒转化大肠杆菌 培养测