生殖毒性.ppt

生殖毒性 第一节概述 哺乳动物的生育繁殖过程外源化学物对生殖发育的影响外源化学物对生殖发育的影响以及损害作用的特点 哺乳动物的生育繁殖过程 生殖发育是哺乳动物繁衍种族的生理过程 其中包含生殖细胞发生 即精子发生和卵细胞发生 配子的释放 性周期和性行为 卵细胞受精 受精卵的卵裂 胚泡的形成 植入或着床 胚胎形成 胚胎发育 器官发生 或称器官形成 胎仔发育 分娩和哺乳过程 生殖发育也可称繁殖过程 概述 外源化学物对生殖发育的影响 干扰生殖发育的任何环节 并造成损害作用 可以通过对内分泌系统 特别是对性腺的作用 发生间接的影响 神经系统对内分泌功能也有调节作用 通过下丘脑 垂体 睾丸轴 下丘脑 垂体 卵巢轴 两条途径作用于生殖发育过程 概述 外源化学物对生殖发育损害作用的特点 生殖发育过程较机体其他系统更为敏感外源化学物对生殖发育过程影响的范围较为广泛和深远 概述 术语基本概念 生殖毒理学 reproductivetoxicology 主要研究外源化学物对生殖细胞发生 卵细胞受精 胚胎形成 妊娠 分娩和哺乳过程的损害作用及其评定 评定方法即为生殖毒性试验 发育毒理学 developmentaltoxicology 主要研究外源化学物对胚胎发育 胎仔发育以及出生幼仔发育的影响及其评定 评定方法称为发育毒性试验 其中主要为致畸试验 概述 第二节生殖毒性及其评定 生殖毒理学历史生殖毒性生殖毒性的评价 生殖毒理学历史 1950年美国霍普金斯大学医院发现 怀孕期间服用黄体酮 先后有600多名女婴出现生殖器男性化畸形 1956年用于治疗妊娠反应的反应停 1961年后出现近万例短肢畸形儿 海豹畸形 二恶英 TCDD 造成的大面积污染及其与人群生殖危害的关系至今仍不清楚 生殖毒性及其评定 生殖毒理学历史 过去半个世纪震惊全球的系列中毒或灾难事件的发生 在世界范围内提高了人们对食品和药物中危险物质的安全意识 高度关注新的化学物对生殖内分泌系统或妊娠结局的不良影响 促进了与生殖内分泌系统安全相关法律的产生和研究方法指南的问世 生殖毒性及其评定 生殖毒性 外源化学物对生殖的过程的损害作用可以表现为性无能或各种形式的性功能减退 雌性可出现排卵规律改变 经期失调 卵巢萎缩 受孕减少 胚胎死亡 生殖能力的降低不孕或不育等 雄性可表现为睾丸萎缩或坏死 精子数目减少 生殖毒性及其评定 生殖毒性的评价 外源化学物对生殖过程作用的评定主要通过生殖毒性试验来进行 生殖毒性试验可以全面反映外源化学物对性腺功能 交配行为 受孕 妊娠过程 分娩 授乳以及幼仔断乳后生长发育可能发生的影响 生殖毒性及其评定 评定的主要依据是交配后母体受孕情况 受孕率 妊娠过程情况 正常妊娠率 子代动物分娩出生情况 出生存活率 授乳哺育 哺育成活率 以及断奶后发育情况等 是检查外源化学物对动物生育繁殖机能有无损害作用的试验 生殖毒性及其评定 生殖毒性的评价 生殖毒性试验 一般是对成年动物进行染毒并试验 包括子代从生殖能力 受孕率 受精卵到性成熟的所有发育阶段 观察期贯穿一个完整的生命周期 以检测近 远期效应 选择各种方案的关键在于试验对生殖和生长发育各阶段的影响无间隔 并可直接或间接评价生殖循环循环的全过程 三段生殖毒性试验 共同要求 动物选择 大鼠是啮齿类首选动物 最常使用的非啮齿类动物是兔 应选择年轻 性成熟的雄鼠与未交配过的雌鼠 雄性大鼠的最适交配日龄为90日 雌性大鼠为80日 小鼠的最适交配日龄为65 80日 家兔小型品种性成熟3 4月龄 中型品种4 5月 大型5 6个月 最适交配日龄后推1个月 动物数 应保证具有统计学意义 除畸胎 流产 全胎死亡等异常情况 啮齿类和非啮齿类动物各选用16 20窝 时间 准确查到精子或阴栓之日计为妊娠d0 仔鼠出生之日定为pd0 剂量选择 根据基础资料确定最高剂量 若资料不足应进行预试验 高剂量组应有轻微母体毒性的剂量 但孕鼠死亡率不得高于10 母体毒性表现为 体重增长减缓或体重增长加快 特别是当激素分泌受干扰时 特定的靶器官毒性 血清学 临床生化学的异常 或过度毒性反应 给药途径 要求与人类预期接触和使用的途径相同 若有动力学资料表明其他途径的合理性 如表现出相似的体内分布 也可作为次选途径 1对生殖能力及从早期胚胎发育到着床 检测从雌雄动物交配前 交配期 直到着床期间进行染毒产生的毒性效应或干扰 雌性动物可检测对雌激素周期 输卵管运输 着床 着床前孕体发育的影响 雄性动物可以检测对生殖功能的影响 精子的成熟 而这些功能改变无法通过雄性生殖器官的组织学检查进行检测 操作步骤 动物选择及数量 最好大树 建议16 20窝交配 交配比例最好为1 1 交配过程应保证可同时确认各窝的父母代动物 交配期一般为2 3周 持续给药其间 一般推荐交配前雄鼠给药4周 雌鼠2周 染毒应持续至雄性动物交配结束后处死 并且至少到雌性动物的整个着床期 评价对雄性的生殖和雌雄交配行为的影响 解剖 雌性动物可在妊娠中期之后的任意时间点解剖 第15天以后 雄性动物可在交配后任意时间解剖 但在已能肯定受孕成功后再解剖 观察指标 试验进行中 每天记录有关症状及死亡 至少2次 周称重及纪录体重变化 交配期每天记录阴道分泌物以确定其是否交配及受试物对性周期的影响及其他相关指标 实验终末指标观察 所有成年动物称重后处死 尸解 对肉眼查见异常的器官进行组织学检查 并保留对照组相应的器官 保留所有动物的生殖系统 睾丸 子宫 卵巢 供组织学检查 精子计数及精子活动能力 着床位置计数 活胎 死胎 吸收胎 晚死胎 计数 对表面看来未孕的大 小鼠 用10 硫化铵进行子宫染色15 20分钟以确定是否有受精卵着床痕迹 结果分析评价 对各项指标的统计分析 对胎儿应以窝为单位 对亲代的资料 以个体或交配对为单位 应考虑受影响的窝的比例 每窝受影响的胎仔的组均百分率 受影响的胎仔总数比例 评价配子成熟 交配行为 孕体着床前的发育 着床 2对胚胎 胎儿发育影响的研究 目的 检测从着床到硬腭闭合期内对雌性动物持续染毒下 对受孕动物和胚胎 胎儿发育的有害影响 主要包括致死作用 生长迟缓和结构异常 注意事项 剂量设计与分组 剂量太大 产生的胚胎毒作用大 结果引起较多的死胎 吸收胎 甚至引起母鼠中毒死亡 剂量太小 低于致畸作用的剂量 则又不引起畸形 一般设3个剂量组 最高剂量组应有轻微母体毒性 最低剂量组不引起明显的毒性效应 试验终末指标 动物处死后 立即从腹中线解剖 称量带胎仔的子宫重 计算第20天孕鼠重减去带胎仔的子宫重 再减去第6天体重后得到孕期增重 在解剖镜下计算黄体数以确定排卵数 仔细观察着床数 活胎 死胎 称量每个胎儿的体重 区别性别 然后从头至脚观察有无畸形 骨骼检查 内脏检查 结果分析和评价 致畸指数 TI 雌性动物的LD50 最小致畸计量 表示致畸强度 致畸指数小于10为基本无致畸危害 致畸指数大于10为有致畸危害 大于100为强致畸危害 相对致畸指数 RTI 成年动物LD01 最小致死剂量 与诱发5 畸形发生率的剂量之比 比值越大 表示致畸度越高 对围生期的发育及母体功能的影响研究 目的 观察从着床到断奶期间染毒对母体妊娠 分娩 哺乳的影响 和对孕体和幼仔发育的影响 染毒时间 妊娠第6天到分娩后第20天出生后观察指标 分娩 哺育 哺乳等情况 子代体重和身长及其生长 发育 出生胎 存活胎 死胎 畸形率 分娩后第21天存活率及功能检测等 试验方法原则受试动物 性成熟大鼠 小鼠或家兔剂量分组 一般设立三个剂量组 至少两个剂量组 和一个对照组染毒途径 动物接触受试物的方法应参照人类实际接触途径动物数 每组雌雄各16到20只 或雌16到20只 雄8到10只 生殖毒性及其评定 生殖毒性的评价 试验方案 三代两窝 生殖毒性及其评定 生殖毒性的评价 F b F a F b F b F a F a 给予受试物 到 周 第一次交配 第二次交配 观察三个月 喂饲普通饲料 观察其生长发育情况 断乳后给予受试物 到 周 观察三个月 喂饲普通饲料 观察其生长发育情况 断乳后给予受试物 到 周 两代一窝 和一代一窝 生殖试验 生殖毒性及其评定 生殖毒性的评价 观察指标 受孕率 反映雌性动物生育能力以及雌性动物受孕情况正常分娩率 反映雌性动物妊娠过程是否受到影响幼仔出生存活率 反映雌性动物分娩过程是否正常幼仔哺育成活率 反映雌性动物授乳哺育幼仔的能力性别比生于指数 受孕雌鼠 同笼雌鼠除上述指标外 还应该注意出生幼仔是否有畸形存在 对死亡的幼仔应进行畸形检查 可为下一步致畸试验提供参考 生殖毒性及其评定 生殖毒性的评价 生殖毒性试验的特殊性 毒性表现形式的多样性 延续性和滞后性动物交配和分娩时间的非同步性多层次分组 给药组及检测指标亚组 统计数据的多样性窝效应和窝大小的不均一性 数据采集 处理和分析的准确可靠性 计算机管理系统 动物的分组 交配前计算机分组交配后计算机自动分组保证较高的动物交配率和受孕率人工分组交配结束前的少量受精鼠 动物的临床观察 自备数据库包含实验动物绝大多数的异常行为体征按发生部位 严重程度和持续时间描述屏幕提示功能提高临床观察的准确性和可靠性 仔鼠的解剖观察 外观 内脏及骨骼畸形检查项的数据库共存有800多种实验动物的常见畸形或变异的名称国际实验动物畸形分类术语为基准采用三级分类系统作观察和记录 外观 内脏及骨骼 1级 身体部位 2级 脏器 脉管或骨骼 3级 生殖毒性试验统计分析的难点 窝效应 同一窝胎鼠的反应比不同窝胎鼠的反应更为相似 胚胎 胎儿终点分析应以窝为试验单位 以胎儿作为试验单位就不能考虑窝内相关性 增加 类错误的概率 降低实验的有效性窝大小差异 每窝的胎鼠数存在较大的差异 以窝为试验单位不能考虑到窝大小差异 同时 窝大小差异还影响胎鼠出生时体重及出生后生长与发育同时存在多种统计资料 连续性计量资料 计数资料 两分类资料 妊娠期母鼠体重 增重及摄食量 Bartlett方差齐性检验 单因素方差分析 重复测量方差分析法分析母鼠妊娠期体重及摄食量的变化趋势 方差不齐则进行Kruskal Willis非参数检验母鼠交配率 受孕率和死亡率 2检验 基于窝的分析 母体毒性指标 基于窝的分析 子代发育毒性指标 黄