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细胞培养基本技术 1 内容 细胞培养的理论背景设备与器材准备 溶液配制无菌技术原代培养传代培养细胞计数与生长曲线冻存 复苏与运送常见问题及对策 2 细胞培养的概念 20世纪初才创立的一种研究动物细胞行为的方法 细胞培养是指从体内组织取出细胞模拟体内出现环境 在无菌 适当温度及酸碱度和一定营养条件下 使其生长繁殖 并维持其结构和功能的一种培养技术 3 细胞培养的应用 1 药物研究与开发 1 新药筛选 2 疫苗研究与开发 3 基因工程药物研究与开发 4 细胞工程药物研究与开发2 基础研究 1 药物作用机理 2 基因功能 3 疾病发生机理3 生物制药 1 疫苗生产 2 基因工程药物生产 3 诊断用和药用单克隆抗体生产 4 细胞工程药物生产 4 细胞培养的应用 5 细胞培养的优点 1 活细胞 能长时间 直接观察 研究活细胞的形态 结构 生命活动2 可控制 可选择特定的研究细胞种类 性质 阶段可控制调节条件 物理 化学 生物等因素可采用各种研究技术 记录方法 倒置生物显微镜 荧光显微镜 电子显微镜 流式细胞术 激光共焦显微镜 免疫组织化学 原位杂交 同位素标记等 3 样品均一性 来源于同一组织同一种细胞 4 经济 规模和机械化 6 细胞培养的局限性 人工模拟体内环境的技术已经很高 但人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同 缺乏体内的系统作用 失去神经体液的调节和细胞相互间的影响 当细胞被置于体外培养后 生活在缺乏动态平衡的环境中 必然发生变化 7 概念 原代与传代 原代培养取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养 传代 细胞在培养器皿中生长一定时间后 被分开接种到新的培养器皿中 8 9 培养细胞的生长方式 贴壁生长 必须贴附于支持物表面才能生长 见于各种实体组织来源细胞 上皮细胞 悬浮生长 于悬浮状态下即可生长 不需要贴附于支持物表面 见于各种造血系统肿瘤细胞 10 11 12 贴壁细胞 13 贴壁细胞 14 贴壁细胞 15 贴壁细胞 16 悬浮细胞 17 细胞培养的环境 1 无污染环境 化学污染 微生物污染2 温度环境 37 偏离这一温度范围 细胞的正常代谢会受到影响 甚至死亡 培养细胞对低温的耐受力较对高温强 3 气体环境 95 空气加5 二氧化碳4 酸度环境 大多数细胞的适宜PH为7 2 7 4 细胞耐酸性比耐碱性大一些 5 细胞培养基 合成培养基 天然培养基 18 细胞培养成功的关键 1 实验材料的清洗 灭菌 2 无菌操作3 勤劳 19 内容 细胞培养的理论背景设备与器材准备 溶液配制无菌技术原代培养传代培养细胞计数与生长曲线冻存 复苏与运送常见问题及对策 20 实验设备与器材 21 CO2培养箱超净工作台 22 倒置显微镜 23 滤器 24 电动移液器超纯水仪 25 液氮罐 26 培养瓶 培养皿 27 实验器材的清洗和灭菌 清洗的重要性1 除化学污染 盐 油污 蛋白质 重金属等2 使培养瓶内表面带负电荷 供细胞附着 不要让污染了的器皿变干 灭菌的重要性除去微生物污染 28 酸液配方 29 新的玻璃器皿的清洗灭菌 自来水刷洗 除去灰尘 烘干 泡盐酸 烤箱中烘干 然后再浸入5 稀盐酸中12小时以除去脏物 铅 砷等物 刷洗 烘干 泡盐酸12小时后立即用自来水冲洗 再用洗涤剂刷洗 自来水冲干净后用烤箱烘干 泡酸 清洗 用酸液浸泡12小时 然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗10次 最后蒸馏水冲洗3 5次 烘干 包装 移液管和滴管的尾端要塞入棉花 高压灭菌烘干备用 30 使用后的玻璃器皿的清洗灭菌 刷洗 烘干 使用过的玻璃器皿立即用清水刷洗干净自来水浸泡过夜 泡酸前用自来水冲洗干净 烘干 泡酸 清洗 烘干后泡入酸液 12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗10次 避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗 过蒸馏水3次 烘干 包装高压灭菌烘干备用 31 金属器皿 金属器皿不能泡酸 洗消时可先用洗涤剂刷洗 后用自来水冲干净 然后用75 酒精擦拭 再用自来水 然后用蒸馏水冲洗 再烘干或空气中晾干 放入铝制盒内包装好 高压灭菌 再烘干备用 32 橡胶和塑料 刷洗 烘干 使用后立即用清水刷洗干净自来水浸泡过夜 泡酸前用自来水冲洗干净烘干 泡入5 盐酸过夜 自来水冲洗10次 过蒸馏水3次烘干高压蒸汽灭菌烘干备用滴管胶头可用75 酒精浸泡5分钟 紫外线照射消毒 33 水 溶液 培养基 水 超纯水 至少为三蒸水或去离子水 34 需配制的溶液 平衡盐溶液 PBS或D Hank s等 胰酶培养基 35 溶液除菌方式 高压蒸汽灭菌 平衡盐溶液过滤除菌 不能高压的溶液 如培养基 胰酶等 36 培养基 培养基 培养液 是维持体外细胞生存和生长的溶液 分天然培养基和合成培养基 天然培养基 天然培养基有血清 血浆 和组织提取液 如鸡胚和牛胚浸液 优点 营养成分丰富 培养效果好缺点 来源受限 成分复杂 影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析 易发生支原体污染 37 合成培养基 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量 用人工方法模拟合成的 目前已设计出许多种培养基 如TC199 MEM RPMI 1640 DMEM等 合成培养基主要成分是氨基酸 维生素 碳水化合物 无机盐和其它一些辅助物质 优点 标准化生产 组分和含量相对固定 成本低缺点 缺少某些成分 不能完全满足体外细胞生长需要 38 人工合成培养基只能维持细胞生存 要想使细胞生长和繁殖 还需补充一定量的天然培养基 如血清 39 血清中含有 多种蛋白质 白蛋白 球蛋白 铁蛋白等 多种金属离子 激素 促贴附物质 如纤粘蛋白 冷析球蛋白 胶原等 各种生长因子 转移蛋白 不明成分 40 血清质量好坏是实验成败的关键 常用血清有胎牛血清 新生牛血清 小牛血清 兔血清 马血清等 其中以胎牛血清质量最好 优质血清的标准 透明 淡黄色 无沉淀物 无细菌 支原体 病毒污染 血清的灭活 消除补体活性 56 30分钟血清的除菌 购买高质量的无菌血清 不要自己试图对血清除菌 41 常用培养基配制要领 购买合成培养基干粉 仔细阅读说明书 确定配制方法 是否需要添加其他成分 如NaHCO3 HEPES 谷氨酸盐等 确保所有的成分完全溶解确保水足够纯 包括调节pH值用液 过滤除菌后取10ml置于干净的培养瓶中 放入培养箱内培养三天 如培养基无改变 方可继续使用 42 培养基配制方法 GibicoDMEM为例 拆开包装 将包装中粉末倒入一个1L烧杯中 用水将包装内壁的粉末冲洗入烧杯中 加入3 7g碳酸氢钠 加水至900ml 调pH值至7 4定容至一升过滤除菌过滤最后取10ml置于干净的培养瓶中 放入培养箱内培养三天 如培养基无改变 则可继续使用 临用前加10 牛血清 43 培养基过滤除菌装置 44 45 培养基过滤装置使用方法 用自来水彻底清洗装置 用蒸馏水漂洗两次 烘干 塑料滤器烘干温度不可超过60度 正确安装好滤膜和整个装置 包装 高压灭菌 46 其他试剂 胰蛋白酶液 0 25 胰蛋白酶 0 02 EDTA 用平衡盐溶液溶解 过滤除菌 平衡盐 高压灭菌 47 内容 细胞培养的理论背景设备与器材准备 溶液配制无菌技术原代培养传代培养细胞计数与生长曲线冻存 复苏与运送常见问题及对策 48 无菌技术 微生物污染一直是细胞培养的主要问题 49 无菌技术总原则 任何时候都要毫不动摇的在每一个操作环节都坚持高标准的无菌技术 预防为主 不要让无菌程度低的物品沾染无菌程度高的物品 50 无菌程度梯度示意图 51 培养室的灭菌 定期打扫培养室室 每周打扫一次 先用自来水拖地 擦桌子 超净工作台等 然后用3 来苏尔或者新洁尔灭或者0 5 过氧乙酸擦拭 CO2培养箱灭菌 先用3 新洁尔灭擦拭 然后用75 酒精擦拭或者0 5 过氧乙酸 再用紫外灯照射 保持培养箱内空气干净 定期消毒 定期更换蒸馏水 实验前灭菌 打开紫外灯20 30分钟实验后灭菌 用75 酒精 3 新洁尔灭 擦拭超净台 边台 倒置显微镜的载物台 打开紫外线照射20 30min 52 实验人员的无菌准备 肥皂洗手 穿好隔离衣 带好隔离帽 口罩 穿好拖鞋戴乳胶手套 75 酒精擦手 53 工作面无菌原则 保持工作面干净 使用前用75 乙醇充分擦洗工作面 打开紫外灯照射30分钟 尽量少放物品 带入必须的 移走不必要的 工作台面内物品整齐有序 实验完毕后移走所有物品 并彻底擦洗工作面 开紫外灯照射30分钟 54 正确的工作台面布局 物品在工作台中部洁净区围成新月状 酒精灯位于中央 55 保持台面整齐 Good Bad 56 无菌操作 凡是带入超净工作台内的酒精 PBS 培养基 胰蛋白酶的瓶子均要用75 酒精擦拭瓶子的外表面靠近酒精灯火焰操作 玻璃器具 滴管 移液管等 使用前必须过火灭菌打开和盖上盖子前后灼烧瓶颈和盖口附近 无菌级别高的物品不能触碰无菌级别低的物品 手不能从敞开的瓶口上方经过各种操作要靠近酒精灯 动作要轻 准确 不能乱碰 如吸管不能碰到废液缸 吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管 防止交叉污染 手握试管 滴管 移液管时尽量远离工作端 尽可能移走不需要的物品 在操作中经常用酒精擦拭台面 尽可能减少开盖时间 随时擦去任何溢出物 57 无菌操作 任何时候都不要把液体从一个无菌容器倒入另一个无菌容器 倾倒废液时防止溅起和瓶口回流 在视野范围内工作 58 无菌技术 每人准备一套实验材料 器皿 溶液等 不可混用 无菌的思想贯穿到细胞培养的任何操作步骤 59 内容 细胞培养的理论背景设备与器材准备 溶液配制无菌技术原代培养传代培养细胞计数与生长曲线冻存 复苏与运送常见问题及对策 60 原代培养 细胞分离之后至第一次传代之前的细胞培养阶段 61 原代培养策略 62 原代培养 分离小鼠胚胎 63 原代培养 分离鸡胚 64 原代培养 酶解组织 65 内容 细胞培养的理论背景设备与器材准备 溶液配制无菌技术原代培养传代培养细胞计数与生长曲线冻存 复苏与运送常见问题及对策 66 概念 代 细胞分裂一次 错 培养物分割成小的部分 重新接种到另外的培养器皿 瓶 内 再进行培养 这个过程就称为传代 passage 或者再培养 subculture 67 传代培养的要诀 一 该出手时就出手 该换液时就要换液 该传代时就要传代 否则 细胞就不是那个细胞细胞会衰退 分化 生长缓慢 多数情况下很难扭转和补救 68 传代培养的要诀 二 勤观察每天肉眼观察培养基颜色是否异常 有无混浊观察培养基颜色变化速度是否异常 变化过慢意味着细胞生长过于缓慢 变化过快而细胞密度并不大 表明有污染的可能性 镜下观察细胞形态 生长速度 观察培养箱水盘中的水是否干净 观察CO2压力表 观察液氮罐内液氮体积 69 传代培养的要诀 三 严格无菌操作轻柔 避免机械力损伤细胞 重悬细胞时尽量用50ml离心管 通过晃动离心管分散细胞 尽量避免过力吹打 离心力不可超过300g 普通台式离心机水平转子1000rpm 快速 防止因过分小心导致操作时间过长 增加污染概率 70 每代贴附生长细胞的生长过程 游离期贴壁期潜伏期对数生长期平台期 71 每代贴附生长细胞的生长过程 游离期 细胞接种后在培养液中呈悬浮状态 也称悬浮期 此时细胞质回缩 胞体呈圆球形 10分钟一4小时贴壁期 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素 胶原等糖蛋白 生长基质 这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上 悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着 进口塑料培养瓶涂有生长基质 化学合成的功能基团 潜伏期 此时细胞有生长话动 而无细胞分裂 细胞株潜伏期一般为6 24小时 对数生长期 细胞数随时间变化成倍增长 活力最佳 最适合进行实验研究 停止期 平台期 细胞长满瓶壁后 细胞虽有活力但不再分裂 机制 接触抑制 密度抑制 尽量避免细胞进入平台期 72 何时换液 pH降低 培养基颜色由红变橙要警惕 变成黄色之前一定要换液 pH降至6 5时 细胞停止生长 降至6 0 细胞失去活性 无法挽救 发现细胞出现形态衰退时须勤换液若培养物密度过低或者生长缓慢 则更换一半培养基 73 贴壁细胞换液的操作 吸出或倒出旧培养基 加入同体积新培养基 74 悬浮细胞换液操作 将培养液移入离心管中1000rpm 5min离心弃上清加入新培养基重悬细胞 移入培养瓶 继续培养 75 何时传代 在对数生长末期传代不可在潜伏期传代 76 贴壁细胞何时传代 细胞密度 90 汇合度 若继续放置超过24h 细胞将脱离细胞周期 再接种需要很长时间才能恢复 须频繁更换培养基时 理想的传代频率 1 2 1 4传代 接种密度104 105 ml 每7天传代一次 常规传代最好依据严格的时间表进行 77 78 79 80 81 82 83 84 贴壁生长细胞传代方法 一 吸尽培养瓶中的培养液 用PBS 或Hank s 洗涤细胞两次 吸光缓冲液 加入0 25 的胰蛋白酶液 0 1ml cm2 到培养瓶细胞面对侧 翻转培养瓶 使胰酶完全覆盖细胞层 静置2 10min 室温或37度 显微镜下动态监测 至细胞变圆隆起 加入含血清培养基以终止消化反应 用吸管吸取瓶内培养基 反复吹打瓶壁细胞 形成细胞悬液 收集细胞悬液于离心管内 1000rpm 5min离心 弃上清 加入培养基重悬细胞 吸取适量细胞悬液 接种于新的培养瓶内 加适量新鲜培养基于接种了细胞悬液的新培养瓶内 将新培养瓶放入培养箱中培养 85 贴壁生长细胞传代方法 一 国内广泛使用的方法 缺点 1 消化时 瓶内液体较多 液体振荡的机械力会使细胞成片脱落 难以形成单细胞悬液 2 培养基消耗较多 3 耗时长 4 须将细胞液移入离心管操作 增大污染的概率 5 两次吹打 对细胞机械损伤较大 86 贴壁生长细胞传代方法 二 87 传代步骤 1 细胞生长至高密度时 即须分殖至新的培养瓶中 一般稀释比例为1 3至1 6 依细胞种类而异 2 材料 2 1 PBS 2 2 trypsin EDTAsolution 0 05 trypsin 0 53mMEDTA 4Na GibcoBRL25300 062 以10ml分装于15ml无菌离心管中 保存于 20 使用前放在37 水槽回温2 3 新鲜培养基2 4 无菌吸管 离心管 培养瓶3 步骤 3 1 吸掉旧培养液 3 2 用D PBS洗涤细胞一至二次 3 3 加入trypsin EDTA溶液 1ml 25cm2 2ml 75cm2 37 作用数分钟 于倒立显微镜下观察 当细胞将要分离而呈现圆粒状时 吸掉trypsin EDTA溶液 若不移去trypsin EDTA 则在trypsin EDTA作用后 加入适量含血清之新鲜培养基终止trypsin作用 离心后再吸掉上清液 3 4 轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落 加入适量之新鲜培养基 以吸管上下吸放数次以打散细胞团块 混和均匀后 依稀释比例转移至新的培养瓶中 以正常培养条件培养 88 传代操作要点 消化温度 室温或37 均可 消化时间 不可太长 不超过10min 不可太短 须形成单细胞悬液 防止细胞成片滑落 4 消化 延长消化时间较容易获得单细胞悬液 轻柔吹打 防止机械损伤 尽量避免刮伤培养瓶细胞贴附面 尤其是塑料培养瓶 否则影响观察 且细胞贴壁不均匀 按时换液和传代 不可拖延 89 悬浮细胞传代 细胞密度 超过1 106 ml 需要频繁更换培养基时 离心法传代 离心 1000rpm 5min 去上清 沉淀物加新培养液后混匀传代 90 细胞传代 什么最难 做一件好事不难 难的是做一辈子好事 传一两代细胞不难 难的是持续稳定的传十几代 几十代细胞 难的是持续稳定的传几个月 几年细胞 材料准备 溶液配制 无菌操作 培养条件 传代时机 传代频率 消化程度 吹打力度 接种密度 均要正确而稳定 91 建议 正式开始实验前 练习细胞传代培养至少2个月 92 内容 细胞培养的理论背景设备与器材准备 溶液配制无菌技术原代培养传代培养细胞计数与生长曲线冻存 复苏与运送常见问题及对策 93 电子细胞计数器 94 细胞计数板 深度1mm 每个大方格是0 1mm3 95 细胞计数操作 制备单细胞悬液 吹打均匀后 转移一小部分样本 500ul 至1 5mlEP管中 加入等体积0 4 台盼蓝染液 75 酒精清洗计数板表面 注意不要划伤计数表面 将已染色待测细胞悬液吹打均匀 然后用移液器吸取20ul细胞悬液沿盖片边缘缓缓滴入 要保证盖片下充满悬液 液体刚好流到计数板凹槽边缘 注意盖片下不要有气泡 也不能让悬液流入旁边槽中 将计数板平放在显微镜载物台上计数 96 97 统计角上四个大格的活细胞数 对于压线细胞的处理 数上不数下 数左不数右细胞团按照一个细胞计 结果计算 细胞悬液的细胞数 ml 四个大格子细胞数之和 4 104 2 98 细胞计数的注意事项 制备单细胞悬液 不可有较多成团细胞 取样均匀 多次取样计数取平均值 细胞密度 每mm2细胞数 100 一般100 300 若须精确定量 则应在500 1000个 如细胞浓度不足 则离心后重悬于更小体积培养基中再重新计数 计算时注意稀释倍数 避免样品在枪头中停留时间过长 将细胞注入计数池中时 注入的量不可过多 不可过少 不可产生气泡 台盼蓝染色时间不可超过30分钟 99 生长曲线的绘制 100 生长曲线的绘制方法 略 取样均匀 多次测量取平均值 101 生长曲线的分析 重要参数1 潜伏期时间2 倍增时间3 平台期密度 102 生长曲线的分析 103 生长曲线的分析 104 内容 细胞培养的理论背景设备与器材准备 溶液配制无菌技术原代培养传代培养细胞计数与生长曲线冻存 复苏与运送常见问题及对策 105 细胞冻存 细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作 细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力 经费 减少污染 减少细胞生物学特性变化 106 细胞冻存和复苏过程中 对细胞最大伤害的是细胞内水形成的冰晶 所以最重要的就是要减少冰晶的形成 1 慢冻快融2 加入细胞保护剂 DMSO 甘油等 107 冻存和复苏的原则 慢冻快融 当细胞冷到零度以下 可以产生以下变化 细胞器脱水 细胞中可溶性物质浓度升高 并在细胞内形成冰晶 如果缓慢冷冻 可使细胞逐步脱水 细胞内不致产生大的冰晶 相反 结晶就大 大结晶会造成细胞膜 纲胞器的损伤和破裂 复苏过程应快融 目的是防止小冰晶形成大冰晶 即冰晶的重结晶 108 细胞保护剂 DMSO 常用的低温保护剂是二甲基亚砜 DMSO 它是一种渗透性保护剂 可迅速透入细胞 提高胞膜对水的通透性 降低冰点 延缓冻结过程 能使细胞内水分在冻结前透出细胞外 在胞外形成冰晶 减少胞内冰晶 从而减少冰晶对细胞的损伤 有毒 强渗透性 可以渗入乳胶手套 109 细胞保护剂 DMSO 使用浓度 5 10 一般用10 复苏时需1 20稀释 从10 稀释到0 5 如果进出细胞速度过快 会对细胞产生渗透性损伤 所以冻存和复苏时要尽量降低细胞内外DMSO的浓度差 DMSO与细胞混合后室温下不能放置超过30分钟溶于水时放热 对细胞损害大 不能将纯DMSO直接加入细胞悬液 少数细胞系对DMSO敏感 冻存时改用甘油 110 满足冻存标准的细胞 形态学健康生长良好处于对数生长晚期无污染 111 冻存液体条件 细胞浓度至少1 106 ml 最好1 107 ml 溶液成分 40 血清 10 DMSO 50 合成培养基 血清含量越高 对细胞保护越好 含量最高可提高到90 112 细胞冻存悬液的制备 一 预先配制冻存液 含10 血清培养基 10 DMSO取对数生长期细胞 经胰酶消化后 加入适量冻存液 用吸管吹打制成细胞悬液 1 106 1 107 ml 1ml分装于冻存管中 密封后标记 按照冷冻程序冻存 113 细胞冻存悬液的制备 二 预先配制2 冻存液 含80 血清培养基 20 DMSO制备单细胞悬液 细胞密度2 106 2 107 ml将细胞悬液预2 冻存液按1 1稀释 直接稀释即可 最佳方法 用枪吸取2 冻存液缓慢滴加入细胞悬液中 边加边摇动离心管 1ml分装于冻存管中 密封后标记 按照冷冻程序冻存 114 细胞冻存悬液的制备 错误方法 制备单细胞悬液将1 10体积纯DMSO加入细胞悬液中 混匀 1ml分装入冻存管 冻存 115 慢冻程序 平均冷度速率 1 min最大冷度速率 1 9 min 116 冷冻方法 一 将冷冻管 管口要朝上 放入纱布袋内 纱布袋系以线绳 通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口 按每分钟温度下降1 2cm的速度 在40分钟内降至液氮表面 停30分钟后 直接投人液氮中 117 冷冻方法 二 先将冻存管放入4 冰箱 约30min接着置于 20 冰箱 约30 60min置于 80 超低温冰箱中放置过夜置于液氮罐中长期保存 20 放置时间不可过长 否则细胞存活率低 可略去这一步 4 30min后直接放入 80 超低温冰箱 118 冷冻方法 三 将冻存管捆绑在一起 外层裹以厚层棉花 置于 80 超低温冰箱中放置过夜 置于液氮罐中长期保存 119 冷冻方法 四 将冻存管放于程序降温盒中 将程序降温盒置于 80 超低温冰箱中放置过夜 置于液氮罐中长期保存 120 冷冻方法 五 程控冷冻柜 121 细胞冻存的注意事项 经常检查液氮灌中液氮的量 从 80度冰箱转移到液氮灌中要非常迅速 如温度超过 50度会显著影响细胞活性 做好标记和记录非常重要 122 冻存细胞的管理 1 新到细胞为第一代 传第二代时尽量多传几瓶 多冻几管作为种子储备 Seedingstock 留一瓶继续传代和使用 2 传代和使用中也可以冻存一些低次代的细胞作为使用者储备 Userstock 3 传代次数较多之后细胞可能已经发生变化 尽量少用种子储备 123 细胞的复苏方法 从液氮中取出冷冻管 迅速放入37 38 水浴中 使其融化 1分钟左右 水面不可没过盖子 防止水污染细胞 注意 冻存管可能爆炸 培养液稀释至原体积的20倍 滴加 10ml 2分钟 先