膜片钳原理ppt课件.ppt

膜片钳技术原理 1 前言一般认为 电生理学研究起于1791年 基本上随电学仪器的进步而发展的 主要经历了微电极技术 电压钳技术和膜片钳技术 微电极技术由来以久 在此基础之上发展起来的电压钳技术为阐明细胞兴奋性的生理机制作出了巨大贡献 在电压钳的基础上 1976年德国马普所的E Neher和B Sakman在电压钳的基础上建立了膜片钳技术 patchclamprecordingtechnique 并首次报道了用膜片钳技术记录到的细胞膜离子通道电流 但是实验记录的背景噪声仍然很大 2 1980年Neher于在一次实验中偶然的向微电极内施加一点负压 20 30cmH2O 封接电阻骤然增大了两个数量级 达到10 100G 且背景噪声显著减低 后来将这种电阻大于giga 109 的封接称为giga seal 1981年 Hamill等在实现giga seal的基础上建立了膜片钳记录的4种基本模式 在此基础上 以后有发展了许多新的记录模式 从而大大扩展了它的应用领域 Neher和Sakman也因此获得1991年度的诺贝尔医学和生理学奖 当今全世界每年有1000篇以上采用膜片钳技术的研究论文发表 3 膜片钳技术的原理膜片钳技术是用微管电极接触细胞膜 以千兆欧姆 gigaohmsealG 以上的阻抗使之封接 使于电极尖开口处相接的细胞膜的小区域 膜片patch 与其周围在电学学上分隔 在此基础上固定电位 对此膜片上的离子通道的离子电流 pA级最小可达0 06pA 进行检测记录的方法 膜片钳技术包括细胞的分离和膜处理技术 膜片钳放大器等试验仪器的安装和调试 微电极的制作 数据的采集和处理技术等 4 膜片钳实验的构成膜片钳实验仪器设备主要有放大器 微型操纵器 微超 倒置显微镜 防震台 屏蔽笼 灌流槽和数据采集和处理设 计算机 其中膜片钳放大器 amplifier 微型操纵器 微操micromanipulator 倒置显微镜 invertedmicroscope 是膜片钳实验区别于一般电生理实验所需要的仪器 5 膜片钳的放大器膜片钳放大器是膜片钳技术的核心仪器 放大器主要有差分放大器 频率提升部分 加法器 瞬时补偿和钳位放大器等部件组成 放大器的核心部分是差分放大器 此差分放大器是一电流 电压转换器 可将记录到的电流以电位差的形式输出 到目前为止放大器的发展已经经历了三代的发展过程 目前普遍应用的膜片钳放大器有德国HEKA公司的EPC系列 最新的产品是EPC 9 和美国Axon公司生产的AxonPatch系列 最新产品是Axon 200B 日本NIHONKOHDEN公司的CEZ系列 国产放大器有华中理共大学的PC 和PC 系列 最新的产品是PC B 上海生理所的IP 型等 6 因为膜片钳实验所用的标本多为急性分离的细胞或是培养的细胞 故需要倒置显微镜放置标本 目前性能最好的倒置显微镜是德国产的Zeiss显微镜 在膜片钳实验中 微操起着十分重要的作用 微操的性能的优劣主要体现在稳定性上 现在使用的微操主要有机械操纵性 三维液压操纵性 压电操纵性 种 其中以压电微超的稳定性最佳 其它相关设备在此不一一介绍 7 合格的微电极是成功封接细胞膜的基本条件膜片钳实验要成功的封接 一是设法造成干净的细胞表面 二是制成合格的电极 电极采用两步拉制工艺 电极的充灌是利用毛细管由尖端通过虹吸作用吸入溶液 再用注射器连接的微细塑料管 由电极粗端插入电极尖端作反向充灌 避免有气泡留在电极尖端 每一种标本的制备方法各不相同 在此不详细介绍 8 膜片钳的四种工作模式1 细胞贴附式 cell attached 2 全细胞模式 whole cellrecording 3 内面向外式 inside out 4 外面向外式 outside out 9 10 以全细胞模式为例对膜片钳作一简要介绍在倒置显微镜下 使微电极逐渐靠近细胞 在微电极接触细胞的同时给与微电极一个小的负压 形成当吉欧封接 再向微电极管内加入一个小的负压 使电极覆盖下的细胞膜破裂 rupture 形成电极内液和胞内液相通 但与浴池内的溶液绝缘 形成全细胞模式 全细胞模式是记录全细胞面积的而不是小片膜的离子电流 虽然电极内的膜片被吸破 但微电极与细胞的封接阻抗很高 100兆欧 这是保持全细胞记录的重要条件 11 电极内液可更换为药物或毒素等非生理性成分 研究药物对电压依赖性通道的影响 从而对通道开关动力学的作用达到从微观水平上研究药物作用的功能机制 也可任意改变膜片内外液的浓度组分 研究各组分对膜通透性的影响 值得注意的是H Ca2 浓度要适宜 也可用相应的激动剂作用于膜受体 在监测离子通道电流流动过程中 了解经G蛋白介导的第二信使作用 研究跨膜信息转导的途径 12 全细胞模式中 电极内液与细胞内液扩散混合会改变胞内液成分而影响细胞的电变化 还使得全细胞记录经常发生rundown现象 用穿孔膜片钳法 perforatedpatch 做成全细胞模式记录即即可避免此情况 即把制霉菌素 nystatin 和二性霉素 amphotericns 充灌到微电极中 与细胞膜的类固醇作用后 形成只允许一价离子通过而较大颗粒成分不能通过的小孔 这些小孔为导电性孔道 不会影响所记录的电流 相比之下制霉菌素效果较好 13 膜片钳实验中几个常用术语吉欧封接 gigantseal 指玻璃微电极与细胞表面接触紧密 在电学上与细胞膜的其它部分相分离 破膜 rupture 是指达到吉欧封接后 再施加一个小的负压 使细胞膜破裂 从而形成全细胞模式 run down在全细胞模式中破膜后 细胞浆在负压的作用下进入微电极中 细胞很快就萎缩 正常情况下 全细胞模式可以维持 个小时左右 14 膜片钳与其它技术的联合应用单一神经元离子通道表达的体外扩增分析这是膜片钳技术与分子生物学技术相结合的一个范例 为抽取单个神经元的胞浆内容 需采用全细胞模式 所用电极尖端直径较一般稍大 抽吸出的胞浆在PCR后行基因分析 重组DNA与离子通道的结构和功能的结合 极大扩展了膜片钳在生命科学领域的应用范围 15 膜片