HE染色与免疫组化

HE染色与免疫组化实验步骤：1) 取材与固定用小号解剖针挑取一定量本室培养之成螨，雌雄各半，用PBS洗去培养物后用擦镜纸包裹，常温浸没于Bouin固定液中24小时。2) 盐酸预处理固定后的粉尘螨以PBS清洗后挑入4的盐酸溶液中浸泡半小时。3) 琼脂预包埋A. 配置1.5琼脂溶液，微波炉中加热至完全溶解，稍冷却后注入自制包埋器。B. 将盐酸处理后的粉尘螨以PBS清洗后挑入琼脂溶液中，让其自然凝固。C. 解剖镜下修整琼脂块，形成边长与虫体对称轴相一致的长方体，虫体位于琼脂块中央。4)脱水、透明与浸蜡A. 将预包埋的尘螨置于50乙醇中2小时（中间换液一次），然后置于70乙醇中室温过夜。B. 第二天取出后依次入梯度乙醇脱水并以二甲苯透明：80乙醇I （1小时）80乙醇II （1小时）95乙醇I （30分钟）95乙醇II （30分钟）100%乙醇I （15分钟）100%乙醇II （15分钟）乙醇：二甲苯（1：1）混合液 （10分钟）二甲苯I、II透明 （共约15分钟）镜下观察至虫体透明即可终止c将经透明的琼脂块取出，按如下流程浸蜡：二甲苯：塑化石蜡（1：1）混合液（10分钟）塑化石蜡I、II、III（各一小时）5)塑化石蜡包埋折叠大小适中的纸盒进行包埋。用镊子轻轻夹取琼脂块，置于纸盒底部并注满石蜡。解剖镜下迅速摆正琼脂块的位置，以便准确选取不同的方向进行切片。待蜡块表面稍凝固后，连同纸盒一起沉入水中，使其迅速冷却。6)切片与展片先对蜡块进行修整，使其边与琼脂块的边相平行。使用手摇轮转式切片机，调整切片厚度为4-6m，连续切片。将恒温水浴箱加热至45左右，同时将已包被Poly-L-lysine的载玻片预热。在载玻片上滴加少许温水，截取适当长度的蜡带，在载玻片上进行展片。晾干后置于60烤箱中2小时，使蜡带贴附牢固。7)HE染色按常规方法进行染色。由于尘螨体积微小，在染色过程中容易掉片，而且各组织嗜染性不同，故在试验中对各步骤进行了一些调整，获得较满意的效果。流程如下：切片常规脱蜡至水化Harrys苏木素染色 20分钟自来水冲洗 0.5盐酸酒精分化 24秒自来水洗并蓝化 510分钟80乙醇 510秒0.5伊红 13秒95乙醇I 1分钟95乙醇II 35秒100%乙醇I、II 各12分钟二甲苯I、II 各12分钟中性树胶封固8)内源性酶的灭活与抗原修复：常规脱蜡至水，30%H2O2 1份+蒸馏水9份混合,室温10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。将切片浸入0.02MPBS缓冲溶液（pH 7.2-7.6）,微波炉中高火加热至沸腾后断电，自然冷却。热修复抗原也可选用0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0）。9）免疫组化滴加5%BSA封闭液, 37 30分钟。甩去多余液体, 不洗；滴加适当稀释的一抗，4过夜（16h以上）。PBS（pH 7.2-7.6）洗10分钟3次。抗体按都按1：100 稀释；滴加生物素化山羊抗兔IgG, 37 30分钟。PBS（pH 7.2-7.6）洗10分钟3次；滴加试剂SABC, 37 30分钟。PBS（pH 7.2-7.6）洗10分钟3次；DAB显色:使用DAB显色试剂盒(AR1022)。取1ml蒸馏水,加试剂盒中A,B,C试剂各1滴,混匀后加至切片。室温显色, 镜下控制反应时间。也可自配显色剂显色。蒸馏水洗涤。苏木素轻度复染。脱