细胞功能实验

MTT物品准备：1ml枪及枪头，200ul枪及枪头，10ul枪及枪头，排枪，15ml离心管，加样槽，96孔板，废液缸，酒精棉球，巴氏吸管，PBS，培养基，胰酶等，1. 用酒精喷洒超净台面，用纸巾擦干，将枪及枪头、废液缸、PBS、酒精棉球等放入超净台内，关闭超净台挡板，紫外照射30min；2. 打开水浴锅，调节水温至37，预热培养基以及胰酶；3. 向显微镜的载物台以及螺旋喷洒酒精，用纸巾擦干；4. 双手喷洒酒精，将细胞从培养箱中取出，置于显微镜下观察细胞(观察内容包括:细胞形态、数量以及生长密度、死细胞的数量、培养液的颜色变化、背景是否干净透亮)；5. 紫外照射完毕后，打开超净台至合适位置，打开超净台的灯以及吹风，双手喷洒酒精后进入超净台，用酒精棉球擦拭超净台面3次，将预热好的培养基以及胰酶擦干管表面水渍喷洒酒精，放入超净台内备用；6. 打开PBS，盖子朝上，放入巴氏吸管（注意:在超净台内打开巴氏吸管包装）；7. 双手喷洒酒精，将需要传代的细胞从培养箱中取出，喷洒酒精，将细胞放入超净台内；8. 打开培养皿上盖置于左侧，左手抓扶培养皿底盘，轻轻摇晃，用1ml枪吸取培养皿内的培养基弃于废液缸中，用PBS洗3次(注意:最后一次将PBS吸尽)，更换枪头；9. 加入胰酶（10cm皿加入1ml，6cm加入0.5ml，六孔板加入0.4ml），喷洒酒精，放入培养箱内孵育，每隔30s观察一次，待细胞形态变圆并且轻轻晃动便脱落时，立即喷洒酒精放入超净台内，加入4倍的培养基终止消化；10. 轻轻吹打细胞使其脱落，将其收集至15ml离心管内，拧紧管盖；11. 离心，1000rpm，5min，加速度为4，温度为26；12. 离心完毕后，将离心管取出，喷洒酒精放入超净台内，弃去上清，根据细胞量加入适量无血清培养基重悬，吸取1ml细胞悬液至EP管中，充分吹打均匀，吸取10ul进行计数；13. 若需要的细胞量为1000个/孔，200ul/孔，6个复孔，7天，因此细胞悬液浓度为5000个/ml，则需要的细胞总量为5万个，培养基总量为10ml。若细胞计数后得细胞数量为X万个/ml，需要从EP管中吸取（5/X）ml的细胞悬液到加样槽中，然后在加样槽中加入（10-5/X）ml的培养基，用排枪上下左右充分吹打均匀；14. 用排枪吸取200ul的细胞悬液与96孔板中，注意每次吸取细胞前必须吹打均匀；15. 待所有细胞株加样完毕后，需要加入一排无细胞的培养基作为对照；16. 在96孔板的边缘的孔内加入150ul PBS，目的是增加湿度，减少培养基的蒸发；（根据细胞的帖壁状态判断加入CCK-8的时间）17. 测量培养基体积，估算液体蒸发量，吸出多余体积，使每孔的液体尽量接近100ul；18. 加入10ul的CCK-8试剂，轻轻拍打孔板使其均匀接触；19. 24h后用酶标仪测量OD值，波长为450nm；20. 最好每天在相同时间加入CCK-8以及测量OD值。数据分析：DMEMCell-对照A1Cell-实验B1DMEMCell-对照A2Cell-实验B2DMEMCell-对照A3Cell-实验B3DMEMCell-对照A4Cell-实验B4DMEMCell-对照A5Cell-实验B5DMEMCell-对照A6Cell-实验B61. 算出DMEM的平均值X;2. 分别用对照组以及实验组的每个数据依次减去X，得（A1-X）、（A2-X）、（A3-X）、（A4-X）、（A5-X）、（A6-X）、（B1-X）、（B2-X）、（B3-X）、（B4-X）、（B5-X）、（B6-X）;3. 将以上所得数据复制到GraphPad中，进行编辑；SOFT AGAR物品准备：1.2%agar，2Xculture，PBS，培养基，胰酶，1ml枪及枪头，200ul枪及枪头，10ul枪及枪头，15ml离心管，50ml离心管，六孔板，废液缸，酒精棉球，巴氏吸管等1. 用酒精喷洒超净台面，用纸巾擦干，将枪及枪头、废液缸、PBS、酒精棉球等放入超净台内，关闭超净台挡板，紫外照射30min；2. 烧开水，将1.2%agar融化至清澈透明；3. 打开水浴锅，调节水温至37，预热2Xculture、培养基以及胰酶；4. 向显微镜的载物台以及螺旋喷洒酒精，用纸巾擦干；5. 双手喷洒酒精，将细胞从培养箱中取出，置于显微镜下观察细胞；6. 紫外照射完毕后，打开超净台至合适位置，打开超净台的灯以及吹风，双手喷洒酒精后进入超净台，用酒精棉球擦拭超净台面3次，将预热好的培养基以及胰酶擦干管表面水渍喷洒酒精，放入超净台内备用；7. 铺底层胶：将1.2%agar与2Xculture按照1：1的比例充分混合均匀，3ml/孔，此时agar的浓度为0.6%，将0.6%agar以3ml/孔加入至六孔板中(注意此过程不要产生气泡！）室温静置2h后转移至培养箱37，30min；8. 打开PBS，盖子朝上，放入巴氏吸管（注意:在超净台内打开巴氏吸管包装）；9. 打开培养皿上盖置于左侧，左手抓扶培养皿底盘，轻轻摇晃，用1ml枪吸取培养皿内的培养基弃于废液缸中，用PBS洗3次(注意:最后一次将PBS吸尽)，更换枪头；10. 加入胰酶（10cm皿加入1ml，6cm加入0.5ml，六孔板加入0.4ml），喷洒酒精，放入培养箱内孵育，每隔30s观察一次，待细胞形态变圆并且轻轻晃动便脱落时，立即喷洒酒精放入超净台内，加入4倍的培养基终止消化；11. 轻轻吹打细胞使其脱落，将其收集至15ml离心管内，拧紧管盖；12. 离心，1000rpm，5min，加速度为4，温度为26；13. 离心完毕后，将离心管取出，喷洒酒精放入超净台内，弃去上清，根据细胞量加入适量无血清培养基重悬，吸取1ml细胞悬液至EP管中，充分吹打均匀，吸取10ul进行计数；若需要的细胞量为1.2万个/孔，600ul/孔，因此细胞悬液浓度为2万个/ml。14. 取15ml离心管，分别加入600ul 2Xculture、600ul1.2%agar、600ul细胞悬液，充分吹打均匀，吸取此细胞悬液1.5ml于已铺好底层胶的六孔板中（注意不能产生气泡）；15. 写上细胞名称，每孔细胞数以及接种日期，放入培养箱中，培养1周左右，其间注意观察细胞状态。2X culture： DMEM粉末 13.5gHEPES 1.5g定容至500ml，测量pH值，过滤保存至4NaHCO3 1.8g 1640粉末 10.4gHEPES 1.5g定容至500ml，测量pH值，过滤保存至4NaHCO3 2.0gFOCI FORMATION物品准备：PBS，培养基，胰酶，1ml枪及枪头，200ul枪及枪头，10ul枪及枪头，15ml离心管，6cm培养皿，废液缸，酒精棉球，巴氏吸管等1. 用酒精喷洒超净台面，用纸巾擦干，将枪及枪头、废液缸、PBS、酒精棉球等放入超净台内，关闭超净台挡板，紫外照射30min；2. 打开水浴锅，调节水温至37，预热培养基以及胰酶；3. 向显微镜的载物台以及螺旋喷洒酒精，用纸巾擦干；4. 双手喷洒酒精，将细胞从培养箱中取出，置于显微镜下观察细胞；5. 紫外照射完毕后，打开超净台至合适位置，打开超净台的灯以及吹风，双手喷洒酒精后进入超净台，用酒精棉球擦拭超净台面3次，将预热好的培养基以及胰酶擦干管表面水渍喷洒酒精，放入超净台内备用；6. 打开PBS，盖子朝上，放入巴氏吸管（注意:在超净台内打开巴氏吸管包装）；7. 打开培养皿上盖置于左侧，左手抓扶培养皿底盘，轻轻摇晃，用1ml枪吸取培养皿内的培养基弃于废液缸中，用PBS洗3次(注意:最后一次将PBS吸尽)，更换枪头；8. 加入胰酶（10cm皿加入1ml，6cm加入0.5ml，六孔板加入0.4ml），喷洒酒精，放入培养箱内孵育，每隔30s观察一次，待细胞形态变圆并且轻轻晃动便脱落时，立即喷洒酒精放入超净台内，加入4倍的培养基终止消化；9. 轻轻吹打细胞使其脱落，将其收集至15ml离心管内，拧紧管盖；10. 离心，1000rpm，5min，加速度为4，温度为26；11. 离心完毕后，将离心管取出，喷洒酒精放入超净台内，弃去上清，根据细胞量加入适量无血清培养基重悬，吸取1ml细胞悬液至EP管中，充分吹打均匀，吸取10ul进行计数；设置细胞数量梯度为100个/孔、500个/孔、1000个/孔。12. 将相应数量的细胞接种至6cm培养皿后，充分吹打均匀，十字摇匀；13. 喷洒酒精，放入培养箱培养15天，期间密切观察细胞，每天换液。结晶紫染色： 双手喷洒酒精，将细胞从培养箱中取出，弃去培养基，用冰冷的PBS洗涤细胞3次； (冰冷的PBS可使细胞保持于最佳形态