qPCR实验从设计primer开始到 计算方法详例.doc

本人在日本留学虽然对于具体的原理不是特别理解，现把详细的实验real time PCR 的实验方法写出来让大家来参考。第一步： primer 设计Primer design:1. Find out the mRNA of related gene, for example: Mus musculus transgelin(Tagln) SM22a, mRNA/nuccore/NM_011526.5NCBI Nucleotide GenBank2. open the website of Primer-Blast /tools/primer-blast/1. Enter accession, gi, or FASTANCBI Reference Sequnece:NM_011526.5 , range2.3.Write the organism that you use for mice for homo sapiens, mice: Mus musculus (taxid:10090)Primer pair 1Sequence (5-3)Template strandLengthStartStopTmGC%Self complementaritySelf 3 complementarityForward primerGCTTTGGGCAGTTTGGCTGTPlus2063165062.0355.003.000.00Reverse primerTCTTATGCTCCTGGGCTTTCTTCAMinus2471869561.8645.833.001.00Product length88Exon junction698/699 (reverse primer) on templateNM_011526.53. 将设计的primer 序列交给公司合成就可以了。提取mRNA1. 对于组织，如血管。在冷的PBS液体中取出血管后马上放入液氮中。带全部样品提取完后， 用粉碎机粉碎。 大概20次/秒速度， 10秒每次，3次。2. 加入1ml Trizon, 常温静止30min3. 放于冰上， 加入200ul chloroform，震荡混匀。 13000rpm, 4， 离心10-15min4. 取上清液， 大概500-600ul5. 加入500ul 2-propronaol， 震荡混匀， 13000rpm, 4， 离心10-15min。（因小鼠组织太小， 加入了4ul Dr.gene, precipitation）6. 去掉液体， 加入80%酒精500ul(一定要用无核酸酶的水， PCR 用水)， 离心13000rpm, 4， 10-15min， 重复操作2-3次。7. 去液体， 干燥，加入PCR用水， 溶解mRNA8. 测量RNA 含量。9. 定量RNA含量，保证样品中有650ng/ul10. RT-RCR5*buffer 4uldNTP 8ulRadom primer 1ulRTace 0.5ulRPI 0.5ulmRNA: 6ul30， 10min； 42，60min；99， 5min；4， 完成后 稀释样品5倍保存待用。18s做内参在保存用样品的基础上再稀释50倍。11. Real-time PCR 每个样品做1次重复SYBR qPCR mix: 7.5ulROX: 0.3ulPrimer F: 0.5025ulPrimer R: 0.5025ulDW 4.695 cDNA: 1.75 HOT start: 1min , 95 ， 1cycle； Amp.2 step: 15s, 95；45s， 60， 50cycle， Melt: 30s, 95。完成后， ROX 做为reference， 导出Ct值最后结果Ct值计算方式例子如：得到的值为sampleTargetCtWT118s9.7WT218s9.84WT318s9.98KO118s9.73KO218s9.61KO318s9.52WT1actin31.95WT2actin32.83WT3actin33.69KO1actin34.07KO2actin34.59KO3actin41.611. 计算actin 18s值 （ct）sampleactin-18sWT122.25WT222.99WT323.71KO124.34KO224.98KO332.09计算WT actin-18s的平均值WT actin-18s average22.98333(WT1,2,3 actin-18s 平均值)计算各样品 减平均值得到值为（ct）sampleActin-18s-(WT actin-18s average)WT1-0.73333WT20.006667WT30.726667KO11.356667KO21.996667KO39.106667计算2 ctWT10.60151