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第二章生化分析 1 第一节生化分析理论知识 生化分析仪主要运用了光谱技术中的吸收光谱法和比浊法 2 1 吸收光谱法 紫外光 波长200 400nm的电磁辐射可见光 波长400 760nm的电磁辐射 3 4 1 吸收曲线 溶液对不同波长光的吸收程度 通常用吸收曲线来描述 横坐标 波长 纵坐标 吸光度 最大吸收波长 max 最小吸收波长 min 吸收峰 5 不同浓度的同一种物质 其吸收曲线形状相似 max不变 不同浓度的同一种物质 在某一定波长下吸光度A不同 在 max处吸光度A的差异最大 此特性可作为物质定量分析的依据 6 2 吸光度的定义 透光率的负对数表示物质对光的吸收程度 即吸光度 A lgI0 ItA 吸光度I0 入射光强度It 透射光强度I0 It 透光率 7 Lambert Beer 朗伯 比尔 定律 当一束平行单色光通过均匀的非散射样品时 样品对光的吸光度与样品的浓度及厚度成正比A CLA 吸光度C 溶液浓度L 液层厚度 吸光系数 浓度1 的溶液在厚度为1cm时的吸光度 8 Lamber Beer定律适用前提条件 Lamber Beer定律成立的条件 被吸收光 入射光 为单色平行光溶液是均匀 无散射 稀溶液 9 吸收光谱法的应用 除特种蛋白外的大部分临床生化项目 10 免疫比浊法 通过物质对光的散射或透射来测定物质含量的方法 透射比浊 自动生化分析仪散射比浊 特定蛋白分析仪或免疫分析仪 11 12 二 生化分析仪分析方法 13 1 终点法 终点法 根据终点吸光度的大小来求出被测物浓度 所有被测物质都被转化为产物 即达到反应终点 14 如何判断终点 通常在反应终点附近连续读两个吸光度 求出两点的平均值 并根据两点的差值判断反应是否达到平衡 A2 A1 0 005 加入样品和试剂 反应开始 A2 15 2 固定时间法 指在时间 吸光度曲线上选择两个测光点 这两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度 利用这两点吸光度差值计算结果 如 碱性苦味酸法测肌酐 16 固定时间法 计算公式 CU A2 A1 K A1 A2 T 吸光度 17 碱性苦味酸法测肌酐 第一个30s 快反应干扰物 微生物 丙酮酸 乙酰乙酸 第二个30s 肌酐80 120s 慢反应干扰物 蛋白 18 3 连续监测法 又称速率法 根据反应速度与待测物的浓度成正比 通过测定一段时间内吸光度的变化速率 A min 来计算待测物的浓度 酶活性测定常用 19 连续监测法 零级反应期 酶促反应速度达到并保持恒定速率进行反应 单位时间内的变化速率恒定不变 在零级反应期单位时间内的吸光度变化 反应速率 A min 与酶活力呈正比 20 21 4 透射比浊法 抗原与抗体结合形成免疫复合物 在反应液中具有一定的浊度 可进行透射比浊测定 用于某些蛋白质和药物浓度的测定 需多点定标 非线性回归 求抗原或抗体的浓度 22 分析参数介绍 必选 8 第一试剂量9 第二试剂量10 总反应容量11 孵育时间12 延迟时间13 连续监测时间14 校准液个数及浓度 23 分析参数介绍 必选 15 校准K值或理论K值16 线性范围17 小数点位数 24 分析参数介绍 单波长双波长 1 概念采用一个波长检测物质的光吸收强度的方式称为单波长方式 在吸光度检测中 使用一个主波长和一个次波长的称双波长方式 25 双波长法 试样溶液在 2和 1两个波长处的吸光度之差 只与待测组分的浓度成正比 而与干扰组分的浓度无关 26 分析参数介绍 单波长双波长 2 双波长的优点 消除噪音干扰 减少杂散光影响 减少样品本身光吸收的干扰 27 分析参数介绍 单波长双波长 3 次波长的确定方法根据干扰物吸收光谱特征 选择次波长 使干扰物在主 次波长处有尽可能相同的光吸收值 被测物在主 次波长处的光吸收值应有较大的差异 一般来说 次波长应大于主波长100nm 28 分析参数介绍 单波长双波长 4 双波长的具体应用对于某些反应速度快且无法设置为两点终点法的分析项目 尤其是单试剂分析中 可以利用双波长的方式来部分消除样品本身的光吸收干扰 29 血清总蛋白 双缩脲法 主波长500nm 次波长576nm 血清白蛋白 溴甲酚氯法 主 次波长分别为600和700nm 钙 偶氮砷 法 主 次波长分别为660 770nm 磷 紫外比色法 主 次波长为340 405nm 镁 二甲苯胺蓝法 主 次波长为505和600nm 30 分析参数介绍 双试剂单试剂 反应过程中只加一次试剂称单试剂方式 加两次试剂便为双试剂方式 目前的生化分析仪大多可用双试剂方式分析 31 分析参数介绍 双试剂单试剂 优点 提高试剂的稳定性 多数双试剂混合成单一工作试剂时 其稳定时间缩短 设置两点终点法 来消除来自样品的光吸收干扰 在某些项目检测时能消除非特异性化学反应的干扰 32 仪器的自动监测 1 试剂空白监测2 试剂空白变化速率监测3 样品信息监测4 结果可靠性监测5 底物消耗的监测6 方法线性范围监测 33 第二节仪器检测原理 一 临床生化自动化分析概述全自动生化分析仪 将分析过程中的取样 加试剂 混匀 保温反应 检测 结果计算和显示以及清洗等步骤进行自动化的分析仪器 34 功能特点 特点 自动化 机械化的仪器设备模仿代替手工操作优点 提高了工作效率减少了主观误差灵敏准确快速标准化 35 分类 管道连续流动式 已淘汰 按结构原理分离心式 已淘汰 分立式干片式 常用于急诊 小型按测定速度分中型大型超大型 模块式 按自动化程度分半自动全自动 36 基本结构 1 样品盘或架2 试剂室和试剂瓶3 反应杯和反应盘4 加样系统5 混匀与搅拌转置 6 温控和定时系统7 光路和检测系统8 数据处理系统9 清洗系统 37 分立式分析仪 38 1 样品盘或样品架 传送条带状样品架 圆盘状样品架 39 样品盘 放置待测样品的转盘 可放置一定数量的样品杯或不同规格的采血试管 通过样品盘的转动来控制不同样品的进样 40 样品架 每个样品架可放数只样品杯或采血试管 多为5只或10只 样品架的移动通过样品传送带来进行 样品架上的条形码或编码孔可识别样品架号及样品位置号 41 2 试剂室和试剂瓶 转盘式试剂室 内装放置试剂瓶的转盘 一般可放置20种以上具有一定形状的塑料试剂瓶 大型分析仪可放置30 45种试剂瓶 试剂瓶容量一般为10 100ml 通过试剂转盘的转动来选用不同试剂 42 转盘式试剂室 43 试剂 条码阅读器 试剂仓 44 3 反应盘和反应杯 比色杯 数量多在100个以上 有些组合式分析仪可有双圈比色杯 数量更多 种类繁多 光径一般为0 5cm 0 6cm 1cm 且大多自动校正为1cm 小孔径比色杯更节省试剂 使用更为广泛 45 46 4 加样系统 由取样针 取样臂 取样管路 取样注射器和阀门组成 能定量吸取样品并加入到反应杯 分为 样品加样和试剂加样 47 样品加样 不同分析仪的取样容量有不同的范围 一般为2 35 l 步进0 1微升不等 取样针设有电子液面感应器 取样针于样品上方下降 一旦接触到样品液面即停止下降而开始吸样 适用于不同的采血试管上机测定 48 试剂加样 取样20 380 l 步进1 5微升不等 有液面感应器功能 提示试剂剩余量 49 5 混匀与搅拌装置 搅拌器 使反应液和样品充分混匀 由电机和搅拌棒组成 在计算机指令下 电机运动使搅拌棒高速转动 执行混匀功能 形状 扁平棒状或扁平螺旋状表面疏水材料 防携带交叉污染 每次搅拌后要清洗 50 6 温控和定时系统 作用 保持反应在恒温下进行 水浴 如 日立系列 优点 温度均匀 稳定 缺点 升温慢 开机预热时间长 水质变化影响测光 空气干式浴 如 AU400 优点 升温迅速 无需保养 缺点 温度易受环境影响 恒温液循环间接加热法 如 AU640 比色杯周围流动一种特殊的恒温液 油 与比色杯间隔几毫米 51 温度一般37 或30 反应时间 8 5 10min 个别15或22min 温度不恒定 会导致测定结果不准确 52 7 光路和检测系统 Io 光电检测器 Electric 1 2 3 信号处理电路 光源 比色杯 光栅 53 光源系统 卤素灯 工作波长325 800nm 氙灯 285 750nm BECKMAN 光源自身产热较严重 附加安装水冷却装置 可延长光源的使用寿命 54 单色器 分光装置 分光装置 包括光栅和滤光片分光方式 大多数仪器使用后分光方式 55 滤光片 滤光片 插入式 旋转式两种方式 易受潮霉变 影响检测结果的准确度 尤其340nm 多用在半自动生化仪 56 衍射光栅通常简称为 光栅 一种由密集 等间距平行刻线构成的非常重要的光学器件 它利用多缝衍射和干涉作用 将射到光栅上的光束按波长的不同进行色散 再经成像镜聚焦而形成光谱 57 光栅 分为 全息反射式光栅和蚀刻式凹面光栅 1mm内蚀刻几百 几千条线 1 分光准确2 寿命长 无需任何保养目前主流的大型生化仪均采用光栅 58 后分光优点 1 可同时选用双波长或多波长测定 降低 噪声 2 光路中无可动部分 减少故障率 提高精度 3 340nm波长的酶类测定结果更稳定可靠 59 检测器 信号检测器 光学信号转化为电信号一般为光电倍增管或光敏二级管 目前高档自动生化仪均采用光导纤维传送技术 60 数据处理系统 仪器计算系统自动生化仪的核心部分 标本识别 混合恒温 数据处理 结果打印以及校准方法 测定方法的选择 质量监控等均由计算机控制完成 61 9 清洗系统 清洗装置防止交叉污染 提高测定的精密度和准确度清洗不好 可能导致交叉污染 62 四 干片式分析仪 干片式生化分析仪 将发生在液相反应物中的反应 转移到一个固项载体上 利用分光检测系统进行监测 多进行反射光检测 干片为一次性使用 成本较贵 多用于急诊检测 63 试纸条结构 密码磁带 位于试纸条背面 储存了检测项目的全部检测程序及全部方法学资料 血浆分离区 位于试纸条正面下部并标以红色 由玻璃纤维和纸层构成 用于阻截红 白细胞 反应区 位于试纸条正面上部 血浆通过血浆分离区被转移介质运送到反应区底部 进行化学反应并检测 64 干片试剂结构示意图 65 三 模块式全自动生化分析展望 一 组合式自动生化分析仪 二 实验室自动化系统 66 四 试剂 一 临床生化试剂的发展历史1 自配简单试剂2 自配多成分试剂3 冻干试剂 干粉试剂 用前要复溶 瓶间差大 4 液体双试剂 稳定 方便 67 二 双试剂的优点1 抗干扰反应能力强 2 增强了工作试剂的稳定性 68 第三节生化分析临床应用 1 肝功能类Tbil Dbil TBA 血氨2 酶类ALT AST ALP ACP LDH GGT AMY CHE CK HBDH CK MB3 蛋白质TP ALB 69 4 糖类GLU 葡萄糖耐量试验5 血脂 脂蛋白 载脂蛋白TC TG HDL C LDL C ApoA1 ApoB6 非蛋白含氮类化合物Urea Cr UA 70 7 无机离子K Na Cl CO2 Ca P Mg Fe TIBC 71 AU680全自动生化分析系统 基本性能 处理能力 800测试 小时 ISE单元 600测试 小时同时测试项目 60项 含电解质 63项分析方法 终点法 速率法 固定时间法 比浊法 电极法 72 AU5800系