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生物制药工艺学 第二十章抗生素 第一节概述第二节青霉素第三节链霉素第四节红霉素第五节四环素 第一节概述 一 定义抗生素是生物 包括微生物 植物和动物 在其生命活动过程中产生的 或在生物产物的基础上经化学 生物或生物化学方法衍生的 在低微浓度下能选择性地抑制或影响生物机能的低分子质量化学物质 天然抗生素 青霉素 头孢霉素 链霉素 红霉素 四环素 半合成抗生素 氨苄青霉素 头孢噻肟全合成抗生素 氯霉素 如何区分抗生素和其他抗菌类药物 克霉唑等 复杂结构蛋白药物 甘氨酸 乙醇 抗生素的发现 History 19世纪70年代 法国Pasteur 发现有些微生物可以抑制炭疽杆菌 提出了利用微生物抑制另一种微生物的现象来治疗一些感染性疾病 到目前为止 有8000多种抗生素 2 3是由放线菌 strepomyces 产生的 并通过化学结构的改造 总共有3万多种半合成抗生素 它们的分子量为100 1200 普遍应用的包括半合成和盐类的抗生素有350多种 其中以青霉素 头孢霉素 四环素类 氨基糖苷类和大环内脂类最多 抗生素的现状 抗生素的分类 根据作用谱分 广谱抗生素 如氨苄青霉素 可抑制G G 细菌抗G 菌的抗生素 如青霉素抗G 菌的抗生素 如链霉素抗真菌的抗生素 如制霉菌素抗病毒的抗生素 如四环类抗生素对立克次体积较大病毒有一定的作用 抗癌抗生素 如阿霉素 Adriamycin 根据结构分类 内酰胺类抗生素 包括其青霉素 头孢菌素类等 它们含有一个四元内酰胺环 为目前最受重视的一类 氨基糖苷类抗生素 包括链霉素 庆大霉素含有氨基糖苷类或氨基环醇大环内酯类抗生素 包括红霉素 螺旋霉素等四环类抗生素 四环素类 土霉素以四个苯为母核 多肽类抗生素 多粘菌素 杆菌肽由产孢子杆菌产生 苯烃基胺类抗生素 氯霉素 甲砜氯霉素蒽环类抗生素 阿霉素 柔红霉素属于抗癌类抗生素 其他 抗生素的应用 医疗上的应用 脑膜炎 抗病毒 抗癌 农业上的应用 抗细菌真菌 杀虫除草 刺激生长 畜牧业上的应用 治疗细菌 真菌 病毒等感染 食品保藏方面的应用 防腐剂 使用量逐渐减少 工业上的应用 提高产率 产品防腐 科学研究中的应用 制备选择性培养基 制备动物模型等 第二节青霉素 1928年由Fleming发现 是青霉菌产生的一类抗生素 对葡萄球菌链球菌及白喉杆菌等都有明显的杀伤 抑制作用 青霉素 Penicillins 青霉素又被称为青霉素G peillinG 盘尼西林 青霉素钠 苄青霉素钠等 能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素 是第一种能够治疗人类疾病的抗生素 青霉素类抗生素是 内酰胺类中一大类抗生素的总称 内酰胺类 Lactamantibiotics 具有4个原子组成的 内酰胺环 抑制细菌细胞壁重要组成成分肽聚糖的合成 杀伤细菌 但由于4环张力大 故其化学性质不稳定 根据 内酰胺环是否还连接有其他杂环以及连接何种杂环可分为 青霉素类 头孢菌素类 非典型 内酰胺抗生素等特点 毒性小 结构宜改造 种类最多 应用最为广泛 一 青霉素结构特征 内酰胺环并噻唑环C6 sidechainC2 COOH其中6 2 位为结构改造尤其是半合成提供可能 有三个不对称碳原子 故具有旋光性 主要的天然青霉素 根据其侧链取代基组成的不同主要可分为以下几种 青霉素G 耐酸差 非肠道 青霉素V 耐酸好 可口服 青霉素X青霉素F青霉素K双氢青霉素F 二 溶解度青霉素游离酸在水中的溶解度很小 易溶于有机溶剂 青霉素钾 钠盐易溶于水和甲醇 三 稳定性干燥纯净的青霉素盐很稳定 青霉素水溶液很不稳定 四 过敏反应 生产工艺的主要步骤 2020 1 5 20 菌种及保存点青霉 penicilliumnotatum 弗莱明 A Fleming 于1929年获得 表面培养只有几个单位 生产能力很低 产黄青霉 P chrysogenum 深层培养初期仅有100U mL 70年代前诱变和随机筛选 据合成途径理性化筛选 原生质体诱变选育 基因工程技术育种 现世界工业发酵水平达100000U mL 具体工艺过程 2020 1 5 21 产黄青霉 Penicilliumchrosogenum 深层培养菌丝形态菌落 平坦或皱褶 圆形 分生孢子 链状 颜色 丝状菌球状菌 黄孢子丝状菌绿孢子丝状菌 发酵单位85000U mL绿孢子球状菌白孢子球状菌 发酵单位高 对原材料 设备要求高 提炼收率低 菌种保存分生孢子 真空冷冻干燥 甘油或乳糖等做保护剂在 70 或液氮 生产常用沙土管保存 菌丝甘油或乳糖等做悬浮剂 在 70 或液氮 分生孢子传代比菌丝传代更易发生变异 故保存其菌丝体可避免传代造成的变异 23 母瓶斜面 甘油 葡萄糖 蛋白胨 拉氏培养基母瓶培养 25 培养6 7天 长成绿色孢子 米孢子 母瓶斜面孢子制成悬液 移植到大米茄子瓶内 25 相对湿度50 45 培养6 7天 制成大米孢子 真空干燥保存备用 生产孢子制备和种子培养 一级种子培养培养基 葡萄糖 玉米浆 尿素 碳酸钙 等控制 温度25 1 通气1 2V V m 搅拌300 350rpm pH自然 时间40 45h 质量 菌丝浓度达40 菌丝形态正常 按接种量10 15 移入二级种子罐 二级种子培养培养基 花生饼粉 葡萄糖 玉米浆 等控制 25 1 1 1 5 250 280rpm pH自然 13 15h 质量 菌丝浓度达40 残糖1 0 以下 菌丝粗壮 III期 无杂菌 效价在700u ml左右 发酵培养 产黄青霉菌生产过程可分为三个不同的代谢时期 菌丝生长繁殖期 青霉素分泌期 菌丝自溶期 2020 1 5 26 工程发酵也会经历类似的时期 产黄青霉菌细胞的生长发育过程按其生长特征可必划分为6个生长期 第 期 分生孢子发芽 孢子先膨胀 再形成小的芽管 原生质未分化 有小空胞 第 期 菌丝增殖 原生质的嗜碱性很强 在 期末有类脂肪小颗粒 第 期 菌丝粗壮 成网状 原生质嗜碱性仍强 形成脂肪粒 积累贮藏物 没有空胞 第 期 菌丝变细 原生质嗜碱性减弱 脂肪粒减少 形成中小空胞 发酵培养 第 期 脂肪粒消失 形成大中型的空胞 其中含有一个或数个中性红染色的大颗粒 第 期 细胞内看不到颗粒 菌丝断裂 并出现个别自溶的细胞 染色很浅 I 期称为菌丝生长期 菌丝的浓度增加 但一般不合成青霉素或合成的青霉素较少 期菌丝适于作发酵罐的种子 V期是青霉素的分泌期 菌丝生长减缓 菌体的代谢从以生长为特征的初级代谢 转入到以合成次级代谢产物为特征的次级代谢 V期合成青霉素的能力最强 期是菌丝自溶期 发酵罐培养基本参数控制发酵罐容积 100m3 装料 80m3 发酵级数 三级 接种量 种子罐10 发酵罐20 发酵周期 180 220h 机械搅拌功率 2 4kW m3 转速 150 200r min 空气流量 30 80m3 m3 h 空气压力 0 2 0 4MPa 罐压 0 03 0 05MPa 液相体积传氧系数 Kla 200 h pH值和温度 前60小时 pH6 4 6 6 26 60小时后 pH6 7 24 菌丝浓度 1 2kg 干重 m3 操作方式 中间带放 反复补料分批发酵 每次带放量10 间隔24h 共6 10次 补料液中葡萄糖浓度 500kg m3 葡萄糖补加率 1 0 2 5kg m3 h 补料液中铵氮浓度 0 25 0 34kg m3 发酵液前体浓度 1 0kg m3 发酵液溶氧浓度 30 饱和度 影响青霉素发酵产率的因素 环境变量 基质浓度 温度 pH值 溶氧生理变量 菌丝浓度 菌丝生长速度 菌丝形态 2020 1 5 31 在分批发酵中 常常因为前期基质量浓度过高 对生物合成酶系产生阻遏 或抑制 或对菌丝生长产生抑制 而后期基质浓度低又限制了菌丝生长和产物合成 为了避免这一现象 在青霉素发酵中通常采用补料分批操作法 即对容易产生阻遏 抑制和限制作用的基质进行缓慢流加以维持一定的最适浓度 青霉素发酵中影响较大的培养基基质有 碳源 氮源 前体 无机盐 基质浓度控制 碳源 产黄青霉菌能利用多种碳源 如乳糖 蔗糖 葡萄糖 阿拉伯糖 甘露糖 淀粉和天然油脂等 双糖 低聚糖和多糖作为碳源有利于青霉素的生物合成 其中以乳糖的效果最好 乳糖能被产生菌缓慢利用而长时间维持青霉素的分泌 故为青霉素生物合成最好的碳源 但因乳糖成本高 普遍使用有困难 葡萄糖对产黄青霉的菌体生长是很好的碳源 工业上常用葡萄糖作为碳源 但对青霉素的生物合成有明显的阻遏作用 这是因为它的分解代谢物会抑制抗生素合成酶而影响青霉素的合成 所以需要严格控制发酵罐中的残糖量 丝状菌 补加糖根据残糖量及发酵过程pH决定 一般残糖降至0 6 以下 pH上升后可开始加糖 每小时加1次 每次加0 07 0 15 h 0 72hr 控制残糖量在0 6 0 8 72hr 放罐 控制在0 8 1 0 球状菌 pH高于6 5时开始加糖 全程pH要求6 7 7 0 根据pH高低增减加糖量 放罐pH要低于7 0 加糖后pH高于要求时 要增加加糖量 pH低于要求时减少加糖量 如果依据尾气中CO2释放率 并测定代谢速率 根据数学模式优化加糖 并应用电子计算机进行过程程序控制 对稳定发酵单位更具有积极作用 氮源 以玉米浆为好 玉米浆是淀粉生产的副产物 含多种氨基酸 如精氨酸 谷氨酸 组氨酸 苯丙氨酸 丙氨酸以及 苯乙胺等 后者为青霉素G生物合成的前体 由于玉米浆价格较高 产量少 所以常用花生饼粉 黄豆饼粉 麸质粉 玉米胚芽粉及尿素等作替代氮源 前体 苯乙酸或其衍生物苯乙酰胺 苯乙胺 苯乙酰甘氨酸等均可作为青霉素G的前体 毒性 这些前体物质对青霉菌都有一定的毒性 特别是苯乙酰胺毒性更大 加入量不能大于0 1 浓度大于0 1 对青霉素产生菌生长和生物合成均有影响 用量加到0 3 菌丝根本不长 前体的毒性取决于培养基的pH 在碱性和中性pH时苯乙酰胺毒性大于苯乙酸 在酸性pH下 苯乙酸毒性较大 为此 在整个发酵过程中前体在任何时候加入的量都不大能于0 1 除基础料中加入0 07 外 其余按需要同氮源一起补入 入Na2S2O3 硫代硫酸钠 能减少它们的毒性 国外报道有利用苯乙酸酯代替苯乙酸 国内将苯乙酸月桂醇酯应用于青霉素发酵摇瓶和实验罐 毒性较低 随着用量增加发酵单位也迅速提高 加入策略 少量多次 或连续滴加 以防止前体对青霉素的毒害 浓度控制 苯乙酸0 1 苯乙酰胺0 05 0 08 加入时期 球状菌发酵因基础培养基中没有前体 所以在培养10h左右就要加入尿素 氨水和苯乙酸的混合料 每3h加1次 由发酵单位增长速度决定加入量 丝状菌 在接种后8 12h 发酵液中残余苯乙酰胺浓度为0 05 0 08 发酵单位上升到2500u ml以上时 开始补加补前体 每4小时补一次 使发酵液中残余苯乙酰胺浓度为0 05 0 08 无机元素 加入的无机元素包括硫 磷 钾 钙 镁等 用量要适当 硫和磷 产黄青霉菌液泡中含有硫和磷 此外青霉素的生物合成也需要硫 据报道 硫浓度降低时青霉素产量减少三倍 磷浓度降低时青霉素产量减少一倍 钙 镁和钾 青霉素生物合成中合适的阳离子比例以K Ca Mg 30 20 41 为宜 阳离子总浓度以300mmol L培养液时青霉素产量最高 如镁离子少 钾离子多时 菌丝细胞将培养基中氨源转化成各种氨基酸的能力强 钙离子影响细胞的生长和培养基的pH 2020 1 5 39 铁 易渗入菌丝内 在青霉素分泌期铁离子总量的80 是在胞内 它对青霉素发酵有毒害作用 必须严格控制铁离子的浓度 一般控制在30 g mL以下 2020 1 5 40 青霉菌生长最适温度高于青霉素分泌最适温度 一般生长的适宜温度为27 而分泌青霉素的适宜温度在20 左右 较高温度 利于生长 缩短生长时间 工业上一般采用变温控制法 且前期罐温高于后期 以适合不同发酵阶段的需要 温度控制 2020 1 5 41 丝状菌合成青霉素适宜pH6 2 6 4 球状菌合成青霉素适宜pH6 7 7 0 在青霉素发酵过程中 如pH过高 可加糖 硫酸铵或无机氮源 pH较低 可加入CaCO3 氢氧化钠 氨或尿素 也可提高通气量 还可采用自动加入酸或碱的方法 使发酵液pH维持在最适范围 以提高青霉素产量 但主要通过流加葡萄糖和氨水控制pH变化 尽量少用加酸或碱控制pH pH控制 2020 1 5 42 pH的变化是反映葡萄糖流加速度高低的指标依据 过多的加糖造成酸性中间产物的积累使pH值降低 过低的加糖不足以中和蛋白质代谢产生的氨或其它生理碱性物质代谢产生的碱性化合物而引起pH上升 所以pH可作为葡萄糖流加控制的依据 加入豆油对pH也有影响 故在加糖时要参考加油的多少 当油量加入较多要适当减少葡萄糖的加入量 2020 1 5 43 若 30 饱和度 产率急剧下降 若 10 造成不可逆的损害 因此 控制临界溶氧浓度不低于饱和溶解氧的30 通气比 青霉素发酵深层培养需要通入一定量的空气 并且不停地搅拌以保证溶解氧的浓度 通气比为1 1 0 0 8V V min 如果溶氧浓度过高说明菌丝生长不良或加糖率过低造成呼吸强度下降 可作为补糖的参考指标 溶氧控制 2020 1 5 44 消沫剂天然油脂如 玉米油 豆油 化学消沫剂如 泡敌 策略早期 泡沫来源与花生饼粉等 间歇搅拌 少加除泡剂 中期 搅拌力度开足 加除泡剂 后期 少加或不加除泡剂 泡沫控制 2020 1 5 45 青霉素发酵过程主要变量的典型变化曲线 pH 湿细胞体积 还原糖浓度 溶氧浓度 青霉素效价 NH4 N浓度 发酵液的处理及过滤 发酵液处理 发酵后立即冷却 抑制菌体生长 增加青霉素的稳定性 过滤方法 应用过滤方法是鼓式过滤及板框过滤相结合的方法 鼓式过滤 粗提液 去除菌体 颜色浑浊 含蛋白质 板框过滤 二次过滤液 溶液呈请 青霉素的萃取纯化 方式 采用多级逆流萃取 常为二级 原理 利用了青霉素在不同pH值时溶解于水和有机溶剂的比例差别明显的特点 萃取注意事项 第一次丁酯萃取时溶液中含蛋白 易乳化 需加去乳化剂 真个过程需低温 尤其是酸化步骤 时间要迅速 尤其在水相的时间 控制丁酯的用量 精制 脱色作用 去除萃取液中的色素及热源 他们都是菌体代谢的副产物 操作 在二次丁酯萃取液中加入活性炭 150 300g 10亿单位 脱水作用 增加青霉素稳定性并利于结晶 操作 18 20度冷盐水冷却 使丁酯萃取液中的水成为冰析出 结晶 晶体结构 Agardiffusionassay agarplate琼脂培养基 第三节链霉素 链霉素 streptomycin 是一种氨基葡萄糖型抗生素 分子式C21H39N7O12 1943年美国S A 瓦克斯曼从链霉素中析离得到 是继青霉素后第二个生产并用于临床的抗生素 它的抗结核杆菌的特效作用 开创了结核病治疗的新纪元 从此 结核杆菌肆虐人类生命几千年的历史得以有了遏制的希望 简介 结构 链霉素抗生素由链霉胍 链酶糖 N 甲基 L 葡萄糖胺构成的糖苷 是氨基苷类抗生素的主要成员 链霉素又名链霉素A是有机强碱 长期使用对地把对脑神经有显著损害 影响听力 链霉素B又名甘露糖链霉素 其为链霉素生物合成的支路产物 生物活性为链霉素A的五分之一 理化性质 溶解度 富含亲水基团 易溶于水 难溶于有机溶剂 物理性质 白色粉末 无嗅 味微苦在水溶液中有4种存在方式 游离碱 一价 二价 三价阳离子 稳定性 干燥粉末较为稳定 受空气和阳光影响不大 暴漏空气中易潮解 链霉素制备工艺 种子培养及发酵产生菌 灰色链霉菌 经过 2个斜面孢子培养1 2级摇瓶种子培养2 3级种子罐扩大培养发酵罐培养 提纯发酵液预处理过滤弱酸阳离子树脂吸附硫酸洗脱强氧离子交换树脂精制弱碱阴离子吸附树脂中和脱色 浓缩 干燥 原理 工艺路线 发酵的影响因素 培养基 碳源 葡萄糖最适 糖酵解途径 单磷酸己糖支路途径 氮源 有机氮源 黄豆饼粉最佳 无机氮源 硫酸铵和尿素 无机元素 磷酸盐 其他无机原料无需添加 发酵条件 溶氧 好氧菌 需增加通气温度 26 5 28摄氏度pH值 接近中性 6 5 7 0 提纯 发酵后处理 发酵液预处理 酸化释放链霉素 加热凝固蛋白 过滤 迅速降温并过滤 Na 弱酸阳离子树脂吸附硫酸洗脱H 强酸阳离子交换树脂精制弱碱阴离子吸附树脂中和脱色 活性炭 浓缩 低温快速浓缩 干燥 喷雾干燥 粉针剂 第四节红霉素 红霉素是由红色链霉菌所产生的大环内脂类广谱抗生素 作用机理在于与细菌的核糖体结合而抑制蛋白的合成 临床上主要用于治疗呼吸道感染 上皮与软组织感染 胃肠道感染等 其副作用小 尤其适用于青霉素过敏者 简介 脱氧氨基己糖 红霉糖 红霉内酯 碱性苷 结构 理化性质 溶解度 易溶于有机溶剂 碱性环境呈游离 酸性环境成盐 便于萃取 温度升高 溶解度降低 物理性质 白色粉末 有一个二甲氨基 呈弱碱性 稳定性 干燥粉末较为稳定 溶液在pH6 8也较稳定 红霉素制备工艺 种子培养及发酵产生菌 红色链霉菌 经过 2个斜面孢子培养2级种子罐扩大培养发酵罐 分批补料发酵 提纯发酵液预处理过滤萃取结晶洗涤 干燥 原理 工艺路线 发酵的影响因素 培养基 碳源 蔗糖最适 补料控制发酵环节 氮源 多用有机氮源 黄豆饼粉最佳 耗尽后开始生产 前体 红霉素C A需补交甲基 甲硫氨酸 内酯环形成需要丙酸或正丙醇 无机