黄崇庭-生化分析仪原理-比色法(朗伯-比尔定律.ppt

生化分析仪分析原理 比色法 美康生物技术支持部广西黄崇庭 A lg I0 It bc 1 前言 ALTASTTBILDBILTPALBALPGGTCRUABUN TCTGHDLLDL CKCKMBHBDHLDH ASORFCRPCCP 生化分析仪 一个可以靠 灯泡 就能检测出人体血清 血浆中的各种成分的仪器 Why Why Why 2 光分析基础知识 2 1光分析法的概念及分类光分析法 基于电磁辐射能量与待测物质相互作用后所产生的辐射信号与物质组成及结构关系所建立起来的分析方法 相互作用方式 发射 吸收 反射 折射 散射 干涉 衍射等根据是否有能级跃迁 可以分为 光分析法 光谱分析法 发射 吸收 原子吸收 分子吸收 散射 拉曼光谱法 非光谱吸收 反射 折射 干涉 衍射等 2 2吸收光谱法定义 各种物质由于其结构不同 对电磁波的吸收也不同 每种物质都有其特征性的吸收光谱 据此可对物质进行定量和定性分析的方法 吸收光谱法 紫外可见光光度法 紫外可见分光光度法是利用被测物质对紫外可见光区辐射的吸收特征和吸收强度 对物质的组成进行定性和定量分析的一种分析方法 属于分子吸收光谱法 原子吸收光谱法 特点 1 灵敏度较高2 精密度和准确度较高3 选择性较强4 仪器设备较简单 操作易掌握 5 应用范围广 2 3紫外可见光光度法基本理论光的基本性质 光的基本性质光是一种电磁波 又表现为光子束流 光的波粒二象性 E hv hc E 光子能量 h 普朗克常数 c 光速 波长由上式公式可知 波长越大能量越小 波长越小 能量越大 吸收光谱 当辐射能通过某些吸光物质时 物质的原子或分子吸收与其能级跃迁相应的能量由基态或低能态跃迁到较高能态 这种由物质对光辐射的选择性吸收而得到的原子或分子光谱称为吸收光谱 物质对光是选择性吸收的吸收曲线 为了精确表明溶液对不同波长光的吸收情况 可将不同波长的单色光依次通过某一固定浓度的有色溶液 测量该溶液对各单色光的吸收程度 即吸光度 以波长为横坐标 吸光度为纵坐标作图所得曲线 即为吸收曲线 或称吸收光谱 物质对光的吸收 关于物质吸收曲线的几点讨论 1 不同物质的最佳吸收波长不一样 2 同一种物质在不同浓度下 吸收程度不一样 但是波长相同 3 根据吸收曲线的特点 可以提供物质的结构信息 是定性分析的依据之一 3 朗伯 比尔定律 吸光光度法定量分析的依据 入射光强度 透射光强度 透光率 两边取负对数 我们将透射光与入射光的比值T称为透光率 T越小 光吸收能力越强 T越大 物质光吸收能力越大 透光率T与吸光度A的定义 公式1 为了表示物质吸收光的强度 我们用吸光度A来表示 将公式两边取负对数得A lg T lg 1 T lg I0 It 公式2是吸光度A的定义式 A值越大 表明物质对光的吸收越大 朗伯定律 当用一种适当波长的单色光照射一固定浓度的溶液时 其吸光度与光透过的液层厚度b成正比 即公式3A K1b比尔定律 当用一种适当波长的单色光照射一溶液时 若液层厚度一定 则吸光度与溶液浓度c成正比 即公式4A K2c 公式2 浓度C恒定时 吸光度A与厚度b成正比 溶液厚度b恒定 吸光度A与浓度C的关系成正比 根据公式3和公式4可知 吸光度A与溶液浓度厚度 浓度均成正比例关系 即朗伯 比尔定律A KbcK是比例系数 也可称为吸光系数 与吸光物质的本性 入射光波长 溶剂及温度等因素有关 吸光系数的物理意义是 吸光物质在单位浓度及单位厚度时的吸光度 在一定条件下 单色光波长 溶剂 温度等 吸光系数是物质的特性常数 同两个能级的跃迁几率有关 不同物质在同一波长的单一色光照射下 具有不同的吸光系数 常作为定性分析的依据 当厚度一定时 吸光度与浓度呈线性关系 吸光系数就是斜率 这是定量分析的依据 吸光系数愈大 灵敏度愈高 吸光系数的影响因素 入射波长 温度 吸光物质性质 溶剂等 吸光系数的讨论 吸光系数常有三种表示方式 1 摩尔吸光系数 当溶液浓度以mol L表示时 液层厚度的单位为cm时 吸光系数表示为摩尔吸光系数 摩尔吸光系数 的意义是浓度为1mol L的溶液 厚度为Icm时的吸光度 的单位是L mol 1 cm 1A bc 2 吸光系数a 当溶液浓度以g L表示时 液层厚度的单位为cm时 吸光系数k表示为吸光系数的单位是L g 1 cm 1A abc摩尔吸光系数与吸光系数a的关系有 M aM一被测物质的摩尔质量 3 百分吸光系数或称比吸光系数到撬 其意义是指浓度为1 W V 的溶液 厚度为lcm时的吸光度 一般吸光物质的吸光系数大于1X104 具有较高灵敏度 小于1X103灵敏度较小 朗伯比尔定律的适用条件 1 入射光为平行单色光且垂直照射 2 吸光物质为均匀非散射体系 3 吸光质点之间无相互作用 稀溶液 4 辐射与物质之间的作用仅限于光吸收 无荧光和光化学现象发生 偏离朗伯比尔定律现象该定律在一个均匀的体系中 吸光物质的浓度不变时 吸光度A与液层厚度b之间的线性关系是普遍成立的 但在实际工作中 吸光度A和浓度c之间的线性关系有时会失效 出现偏离朗伯比尔定律的现象 是个有限的定律 引起偏离的因素 1 吸光物质浓度 Lambert Beer定律通常只适用于稀溶液 当c 0 01mol L时 吸光粒子彼此靠近 粒子的电荷分布发生改变 从而影响单个粒子独立吸收特定波长光的能力 导致对比尔定律的偏离 当c 0 01mol L时 一般对分子间的相互影响可忽略不计 2 非单色光 Lambert Bee定律是以单色光作入射光为前提推导出来的 在实际工作中 分光光度计是由滤光片或单色器从连续光谱中分离出来的一小段波长范围的复合光 这就可能造成对Beer定律的偏离 为了保证测定有较高的灵敏度 通常选择吸光物质的最大吸收波长作为分析用波长 在最大波长处 曲线一般较为平坦 吸光系数变化不大 对Lambert Bee 定律的偏离程度较小 3 光的散射 当试样有胶体 乳浊液或悬浮物质存在时 入射光通过溶液后 有部分光会因散射而损失 使吸光度增大 导致对光吸收定律的偏离 质点的散射强度是与入射光波长的四次方成反比 所以散射对紫外光的测定影响较大 4 光的折射 溶液的折射率随其浓度的改变而改变 而溶液的吸光系数和溶液的折射率有关 所以 当测定溶液浓度相差较大时 引起折射率明显变化 造成吸光系数随之而改变 导致偏离Beer定律 在实际工作 当浓度c 0 01mol几时 折射率基木不变 这一影响可以忽略 5 化学因素 被测组分在测定试液中发生离解 缔合 光化学或互变异构等作用时 可能使被测组分的浓度发生变化 导致对Bee 定律的偏离 6 仪器因素 仪器光源不稳定 实验条件的偶然变动问题 都会给测定带来一定的误差 导致对光吸收定律的偏离 吸光度的加合性当溶液中有多种吸光物质时 总吸光度等于吸收介质内各吸光物质吸光度的总和 即吸光度具有加和性 这是进行多组分光度分析的理论基础 A总 A1 A2 A3 AN空白调零 用参比溶液调T 100 A 0 再测样品溶液的吸光度 即消除了吸收池对光的吸收 反射 溶剂 试剂对光的吸收等 4 紫外可见光分光光度计 全自动生化仪的前世 紫外可见分光光度计 是在紫外可见光区任意选择不同波长的光来测定吸光度的仪器 1 光源 要求有能发射强度足够而且稳定的 具有连续光谱的光源 紫外光区和可见光区通常分别用氛灯和钨灯两种光源 1 卤钨灯和钨灯 适用范围为350 2500nm 适宜于可见及近红外光谱区的测量 2 氢灯和氖灯 发射150 400nm的连续光谱 使用范围为200 375nm 3 氙灯 适用工波长范围为180 1000nm 卤钨灯 氢灯 氙灯 2 单色器单色器是一种将来自光源的复合光分解为单色光 并分离出所需波段光束的装置 是分光光度计的关键部件 主要由入射狭缝 出口狭缝 色散元件和准直镜等部分组成 3 吸收池按材料分为石英吸收池和玻璃吸收池两种 前者适用于紫外可见光区 后者只能用于可见光区 通常为矩形截面 相同厚度相同质量的一组吸收池之间其透光率相差应小于0 5 o 光学玻璃适用透过率 320nm 2500nm紫外石英适用透过率 190nm 2500nm红外石英适用透过率 220nm 3500nm 塑料比色皿适用透过率 340nm 900nm 4 检测器检测器的作用是检测光信号 将光信号转变为电信号 分光光度计一常采用光电管 光电倍增管或光电二极管阵列作为检测器 光电二极管 光电倍增管 光电管 5 显示装置和自动控制系统光电流输出电信号 需经放大后才能以某种方式将测定结果显示出来 常用的显示装置有检流计 微安表 电位计等电表式指示 光度计基本类型 5 光度法误差来源及条件选择 为了确保分析方法具有高灵敏度和高准确性 必须明确误差来源和选择适当的测定条件 误差来源 1 化学误差 吸光物质在溶液中由于浓度的改变而引起离解 缔合或溶剂化等现象 使吸光物质对光吸收的选择性及强度发生质的改变 这类误差称为化学误差 因此被测溶液的浓度过大 C 0 01mol L 常会出现工作曲线弯曲的现象 如果在工作曲线弯曲部分求得样本浓度 必然造成较大测定误差 因此测定中必须确定合适的线性范围 2 仪器误差 仪器误差主要是指由透光率读数及杂散光影响等因素所引起的误差 A 入射光的 非单射性 真正单色平行光是不存在的 一般指波长在一定范围内的复合光 B 杂散光的影响 杂散光是指仪器内部通过非预定途径照射到检测器上的额外的光辐射 这主要是由于仪器光学系统不完善所造成 C 透光率读数的影响 任何紫外分光光度计都有一定的测量误差 这一误差可能来源于光源 检测器和显示系统等的测量误差的总和 最后表现为仪器的读数误差 利用 T与Oclc相应的数据作图 可从图得出 当透光率读数为36 8 即吸光度A为0 434时 其浓度测量的相对误差最小 当 T 0 01时 相对误差为2 7 透光率太大或太小 浓度测量的相对误差均较大 透光率在15 65 即吸光度在0 2 0 7时 浓度测量的相对误差较小 分析条件选择1 仪器条件的选择 入射光波长的选择 选择最大吸收波长 Amax 的光作为入射光 其特点是 在此波长下测定 吸光系数大 可以得到最大的测量灵敏度 当最强吸收峰的峰形比较尖锐时 往往选用吸收稍低 峰形稍平坦的次强峰或肩峰进行测定 当有干扰物质存在时 有时不可能选择最大吸收波长作为入射光 此时则可根据 吸收尽可能大 干扰尽可能小 的原则来选择入射光波长 灵敏度虽然稍差 但仍可得到相当准确的满意结果 狄缝宽度的选择 狭缝宽度影响测定的灵敏度和校正曲线的线性范围 狭缝宽度大 入射光的单色性差 会使灵敏度下降 校正曲线偏离Lambert Bee 定律 但狭缝宽度太小 光强度太小 吸收池的选择 测定时吸收池的厚度应一致 透光性能要好 对于吸光度A0 65的溶液 应选用薄的吸收池 使吸光度A控制在0 2 0 65范围内 从而减少测定的光度误差 2 选择适当的吸光度范围 对同1台仪器 T为一定值 当吸光度读数落在0 2 0 65范围内 测定结果的相对误差较小 因此 需调节测定溶液的浓度 使其吸光度落在此范围内 3 选择适当的空白溶液 测录吸光度时 通常利用空白溶液来调节仪器零点 这样可以消除由于吸收池壁及溶剂对入射光的反射和吸收带来的误差 如果空白溶液选择不当 会使标准溶液不通过原点或不成直线 溶剂空白 选择原则 当显色剂及其它试剂均无色 被测试样中又无其他有色离子时 选用溶剂参比 操作方法 不加样品和任何试剂 用纯溶剂 如蒸馏水或其他有机溶剂 作参比溶液 试剂空白选择原则 当显色剂本身有颜色或其它试剂有颜色 被测试样中又无其他有色离子时 选用试剂参比 操作方法 用不加试样 用蒸馏水或其他纯溶剂代替试样 而显色剂和其他试剂都相同的溶液作参比溶液 样品空白 选择原则 当试样溶液有颜色 而试剂 显色剂均无颜色时 选用样品空白 操作方法 用不加显色剂的样品溶液作参比溶液 平行操作空白 选择原则 当操作过程中由于试剂 器皿 水和气等因素引入了一定量的被测试样组分的干扰离子 操作方法 按试样组分完全相同的操作步骤 用不加被测试样组分的试样进行平行操作 以消除操作过程中引入干扰杂质所带来的误差 不显色空白 在有的显色反应中 如改变试剂加入顺序或改变操作条件 如应加热改为不加热 可使显色反应不发生 这样配制的空自溶液中有样品溶液或试剂的颜色 但待测组分未能显色 由于条件改变 即称为不显色空白 6 郎伯比尔定律的定量分析方法 6 1微量单组分测定 1 标准曲线法 根据Lambent Beer定律 在液层厚度 测定波长和其他测试条件保持不变时 则在一定浓度范围内 测得的吸光度与溶液中待测物质的浓度成正比 因此 可以用标准曲线法 称为校正曲线法或工作曲线法 进行定量 标准曲线法是配制一系列不同浓度C的标准溶液 以不含被测组分的空自溶液为参比 在相同条件下测定标准溶液的吸光度A 绘制A C曲线 这种曲线就是标准曲线 在相同条件下测定未知样品的吸光度 从标准曲线上就可找到与之对应的样品浓度 标准曲线法计算方式 因素法 A KC 所以C A K K是曲线的平均斜率 但是生化仪喜欢将K 1 K 所以C K A 不同生化仪定标结果中的定标因子含义可能不同 后续 标准曲线法计算方式 利用最小二乘法 线性回归计算Y aX bR2为相关系数 可以反映吸光度和浓度相关关系是否良好 Y为吸光度A X