第十一章 荧光分析法.ppt

荧光分析法第一节概述 当紫外线照射到某些物质的时候 这些物质会发射出各种颜色和不同强度的可见光 而当紫外线停止照射时 所发射的光线也随之很快地消失 这种光线被称为荧光 fluorescence 由于不同的物质其组成与结构不同 所吸收光的波长和发射光的波长也不同 利用这个特性可以进行物质的定性鉴别 如果该物质的浓度不同 它所发射的荧光强度就不同 测量物质的荧光强度可对其进行定量测定 荧光分析法 fluorescenceanalysis 就是利用物质的荧光特征和强度 对物质进行定性和定量分析的方法 在紫外光或波长较短的可见光照射后 一些物质会发射出比入射光波长更长的光 荧光 以测量荧光的强度和波长为基础的分析方法叫做荧光光度分析法 1 荧光的定义 荧光分析法具有灵敏度高 比分光光度法高103 104倍 线性范围宽 方法简便快速且选择性较好等多优点 近20年来 各式各样新型荧光分析仪不断问世 荧光分析法发展迅速 应用面日益拓宽 尤其是在生物试样的分析及生命科学研究方面 如DNA序列分析等 展现出广阔的前景 一 荧光的产生物质分子的能级包括一系列电子能级 振动能级和转动能级 分子吸收能量后 从基态最低振动能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态的不同振动能级 这一过程速度很快 大约10 15s 成为激发单重态分子 激发态分子不稳定 可以通过以下几种途径释放能量返回基态 1 振动驰豫2 内转换3 荧光4 系间窜跃5 磷光 第一节基本原理 一 荧光的检测 光源发出的紫外可见光通过激发单色器分出不同波长的激发光 照射到样品溶液上 激发样品产生荧光 样品发出的荧光为宽带光谱 需通过发射单色器分光后再进入检测器 检测不同发射波长下的荧光强度F 由于激发光不可能完全被吸收 可透过溶液 为了防止透射光对荧光测定的干扰 常在与激发光垂直的方向检测荧光 因荧光是向各个方向发射的 二 激发光谱与荧光光谱的形成 任何荧光物质 都具有两种特征光谱 即激发光谱 excitationspectrum 和荧光发射光谱 fluorescenceemissionspectrum 1 激发光谱保持荧光发射波长不变 即固定发射单色器 依次改变激发光波长 即调节激发单色器 测定不同波长的激发光激发下得到的荧光强度F 即激发光波长扫描 然后以激发光波长为横坐标 以荧光强度F为纵坐标作图 就可得到该荧光物质的激发光谱 激发光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大激发波长 是激发荧光最灵敏的波长 物质的激发光谱与它的吸收光谱相似 所不同的是纵坐标 2 荧光光谱荧光光谱 又称发射光谱 保持激发光波长不变 即固定激发单色器 依次改变荧光发射波长 测定样品在不同波长处发射的荧光强度F 以发射波长为横坐标 以荧光强度F为纵坐标作图 得到荧光发射光谱 荧光发射光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大发射波长 三 影响荧光产生及荧光强度的因素 一 物质产生荧光的必要条件 一种物质能否发荧光以及荧光强度的高低 与它的分子结构及所处的环境密切相关 能够发射荧光的物质都应同时具备两个条件 1 物质分子必须有强的紫外吸收 有 跃迁 2 物质具有较高的荧光效率 fluorescenceefficiency 荧光效率也称荧光量子产率 用 f表示 可见 凡是使kF增加 使其它去活化常数降低的因素均可增加荧光量子产率 通常 kF由分子结构决定 内因 而其它参数则由化学环境和结构共同决定 二 影响荧光及其强度的因素 跃迁类型 如上所述 物质必须在紫外可见区有强吸收和高荧光效率才能产生荧光 具有 跃迁的分子才有强吸收 跃迁的 大 共轭效应 大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂环 具有共轭的 跃迁 其共轭程度愈大 荧光效率也愈大 且最大激发和发射波长都向长波长方向移动 如苯 萘 蒽三种物质 刚性平面结构 当荧光分子共轭程度相同时 分子的刚性和共平面性越大 荧光效率越大 取代基团温度溶剂pH值 荧光熄灭由于荧光物质分子间或与其它物质相互作用 引起荧光强度显著下降的现象叫做荧光熄灭 quenching 或猝灭 引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂 如卤素离子 重金属离子 氧分子 硝基化合物 重氮化合物和羧基化合物等 造成荧光熄灭的原因有多种 1 激发态荧光分子和熄灭剂分子碰撞 将能量转移到熄灭剂而使荧光熄灭 2 荧光分子与熄灭剂分子作用生成了本身不发光的配合物 3 荧光物质分子中引入重原子后 易发生系间窜越而转变为三重态 4 当荧光物质浓度较大时 激发态分子和基态分子发生碰撞 产生荧光自熄灭现象 溶液浓度越高 自熄灭现象越严重 5 溶液中溶解的氧分子能引起几乎所有的荧光物质产生不同程度的荧光熄灭 荧光熄灭是荧光分析的不利因素 但是如果一个荧光物质在加入某种熄灭剂后 荧光强度的减小和熄灭剂的浓度呈线性关系 则可以利用这一性质建立熄灭剂的荧光分析法 称为荧光熄灭法 荧光熄灭法比直接荧光法更灵敏 更有选择性 例如铝 桑色素配合物的荧光强度因微量氟离子的存在而引起荧光熄灭 利用这种性质可测定样品中微量氟离子的含量 这时溶液的荧光强度和氟离子浓度成反比 第二节定性定量分析 一 荧光强度与溶液浓度的关系 分光光度法是测定物质对光的吸收程度 荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光之后 物质本身所发射的荧光强度 当溶液中的荧光物质被入射光激发后 可以在各个方向观察到荧光 由于激发光一部分可透过溶液 所以在透射光方向观察荧光是不适宜的 一般是在与透射光垂直的方向观察荧光 测定荧光强度时 要选择两个不同的波长 一个是物质吸收的光 即激发光的波长 另一个是被激发物质发射的光 即荧光的波长 在稀溶液中 荧光强度If与入射光的强度Io 荧光量子效率 f以及荧光物质的浓度c等有关 可表示为If K fIo bc 式中K为比例常数 与仪器性能有关 为摩尔吸光系数 b为液层厚度 由此可见 当仪器的参数固定后 以最大激发波长的光为入射光 测定最大发射波长光的强度时 荧光强度If与荧光物质的浓度c成正比 对于某种荧光物质的稀溶液 在一定的频率及强度的激发光照射下 当溶液的浓度足够小使得对激发光的吸光度很低时 所测溶液的荧光强度才与该荧光物质的浓度成正比 当abc 0 05 即溶液很稀 时 对于一定的荧光物质 当测定条件固定时 式中K为常数 因此 在低浓度的情况下 荧光物质的荧光强度与浓度呈线性关系 3 荧光强度与浓度的关系 对同一物质而言 若abc 1 0 05或0 03 即对很稀的溶液 荧光强度F与该物质的浓度c有以下的关系 F 2 303 fI0a b c 式中 f 荧光过程的量子效率 I0 入射光强度 a 荧光分子的吸收系数 b 试液的吸收光程 I0和b不变时 F K C 即对一定的荧光物质的稀溶液 abc 0 05 在一定的温度下 当激发光的波长 强度和液层厚度都固定后 其荧光强度与该溶液的浓度成正比 这是荧光分析定量的基础 第三节仪器 一 仪器的构造及原理 仪器类型很多 基本结构相似 一般包括五部分 激发光源 单色器 样品池 检测器和记录显示部分 1 光源能发射紫外到可见区波长的光 强度大 稳定 常用的有溴钨灯 高压汞灯 氙灯 二 仪器类型1 光电荧光计用滤光片作单色器 激发滤光片和荧光滤光片 溴钨灯或高压汞灯作光源 光电管为检测器 2 荧光分光光度计用氙灯作光源 光栅作单色器 光电倍增管为检测器 可连续扫描激发光谱和荧光光谱 仪器光路示意图 闪烁Xe灯 狭缝 反光镜 光栅 激发单色器 发射单色器 滤光片 反光镜 棱镜 光电倍增管 参比信号 液池 光电倍增管 样品信号 参比检测器 WGY 10型荧光分光光度计具有双单色器 可以记录物质的激光光谱和荧光光谱 采用计算机完成仪器的系统控制和数据采集 其工作原理如下 由光源发出的光 通过激发单色器后变成单色光 而后照在荧光池中的被测样品上 由此激发出的荧光被发射单色器收集后 经单色器分散成单色光而照射在光电倍增管上转换成相应的电信号 经放大器放大反馈入A D转换单元 将模拟电信号转换成响应的数字量 并通过显示器或打印机显示记录下被测样品的图谱 这就是荧光光度计的基本工作原理 WGY 10荧光分光光度计仪器的使用点击电脑桌面 WGY 10荧光分光光度计 的图标进入 WGY 10 友好界面 此时分别进行激发光珊检零 激发光珊检索为起始波长 激发光珊检索为起始波长等一系列检索 约3分钟点击菜单栏 发射 图标先固定发射波长为400nm 出现 正在检索发射波长 请稍等 如荧光强度大于50 负高压选95 荧光强度小于50 则选100工作模式 激发扫描起始波长 250终止波长 350负高压为 100 95 点击 单程 输入通道号 出现激发光谱 通道1 然后点击 读取数据 进入 自动寻峰 保存 txt文件 清除当前 建立 在曲线上找最大激发波长297nm 再选定激发波长297nm 正在检索激发波长 工作模式 发射扫描起始波长 350终止波长 500负高压为 100 90 点击 单程 输入通道号 出现发射光谱 通道2 然后点击 读取数据 进入 自动寻峰 保存 txt文件 清除当前 建立 在曲线上找最大激发波长397nm点击文件 选择保存 再选定发射波长397nm 起始波长改为250nm点击 单程 选择通道2 则出现水杨酸溶液的光谱图 含激发光谱和发射光谱 点击保存文本文件 在点确定 输入文件名 保存 点击 工作 再点 定量测量 出现 定量测量 标准曲线 点击 编辑 修改浓度单位ug mL 确定点击 添加 依次输入浓度0 1 2 2 4 3 6 4 8 6 0再分别点击 本底测量 单项测量 最后点击 计算标准曲线 最后 样品测量 后期作图1 打开origin软件 x txt 找到已保存的文件 两个通道 Add OK点击 Add Add OK 出现光谱图2 双击XAXTSTITLE 出现对话框 改为x nm 双击yAx改为y F 点击图标 移动鼠标到峰点 再点T图标 再点左键 输入数值297nm重复再输入另一峰值重复输入excitationemission即成3 再点击File 电脑左上方 saveproject 点击 输入文件名 点保存 4 最后点击 Edit 在File后 点击copypage 即可复制在word文档 这件完整的图形即可在用U盘拷贝了 岛津荧光分光光度计RF 5301荧光分光光度计是由日本岛津公司生产 采用对应的windows工作站直接控制主机 并进行数据处理 在windows的操作环境下 利用鼠标 按键 进行测定 数据分析 编辑和记录等系列操作 采用图表复制功能 能方便地把测定数据集光谱输入 文字处理和表处理软件结合在一起的全自动操作系统 本光度计的样品室宽大可安装微型样品池 高灵敏度样品池或流动样品池等附件 适用于多种测定采用全息光栅光学系统和数字信号处理使本仪器能达到很高的灵敏度 岛津荧光分光光度计一 操作步骤1 启动RF 5301软件进入RF 5301系统 仪器开始自检 2 在CONFIGURE 参数 菜单栏中选择PCCOMNFIGURATION 电脑参数设置 栏 选择PC机接口为1打开光度计电源3 在ACQUIREMODE 工作方式获得模式 菜单栏中选择工作方式 SPECTRUM光谱QUANTITATIRE定量分析TIMECOURSE时间扫描4 在CONFIGURE栏中选择 参数栏 进行试验参数设定如激发波长检测荧光范围本试验先固定发射波长400nm 在250 350nm进行激发波长扫描获得溶液的激发光谱图在固定激发波长为 最大激发波长 在350 500 进行发射波长扫描获得溶液的发射光谱图5 放置样品6 单机显示屏右下角的 入键查找最佳发波长扫描激发光谱得excitation 300nmemission 400nm7 单机显示屏右下角的start菜单键开始扫描并记录发光谱8 再重复至 改为发射光谱固定激发波长为300nm得发射光谱图9 选择presentation 描述 表达 菜单栏中的graph图形处理 limits 坐标 yaxis竖坐标xaxis横坐标把激发 发射光谱图放到一起