荧光光谱仪原理及其使用方法(哪些峰不是样品峰).ppt

岛津荧光光谱仪RF 5301PC 岛津国际贸易 上海 有限公司 处于基态的分子吸收能量 电 热 化学和光能 被激发至激发态 然后从不稳定的激发态返回至基态并发射出光子 此种现象称为发光 发光分析包括荧光 磷光 化学发光 生物发光等 物质吸收光能后所产生的光辐射称之为荧光和磷光 分子发光 不同类型的发光 最普通的是荧光 如果当一个物质吸收一定波长的光然后给出较长波长的光称为荧光 一些油漆 纸张具有荧光特性 其次是磷光 当一种物质吸收光 然后再发出光称为磷光 如果磷光物质暴露在阳光下 然后再带到暗室内 给出的光称为磷光 化学发光 当2种化学物质混合后给出的光 萤火虫发光是一种生物发光 萤火虫会产生 荧光素酶 导致发光 类似化学发光 两种生物化学物质混合产生光 分子吸收 荧光 磷光辐射跃迁 无辐射跃迁 去活化过程处于激发态分子不稳定 通过辐射或非辐射跃迁等去活化过程返回至基态 这些过程包括 1 振动弛豫在液相或压力足够高的气相中 处于激发态的分子因碰撞将能量以热的形式传递给周围的分子 从而从高振动能层失活至低振动能层的过程 称为振动弛豫 2 内转换对于具有相同多重度的分子 若较高电子能级的低振动能层与较低电子能级的高振动能层相重叠时 则电子可在重叠的能层之间通过振动耦合产生无辐射跃迁 如S2 S1 T2 T1 定性分析任何荧光都具有两种特征光谱 激发光谱与发射光谱 它们是荧光定性分析的基础 1 激发光谱改变激发波长 测量在最强荧光发射波长处的强度变化 以激发波长对荧光强度作图可得到激发光谱 激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似 经校正后二者完全相同 这是因为分子吸收光能的过程就是分子的激发过程 激发光谱可用于鉴别荧光物质 在定量时 用于选择最适宜的激发波长 2 发射光谱发射光谱即荧光光谱 一定波长和强度的激发波长辐照荧光物质 产生不同波长的强度的荧光 以荧光强度对其波长作图可得荧光发射光谱 由于不同物质具不同的特征发射峰 因而使用荧光发射光谱可用于鉴别荧光物质 萘激发 荧光 磷光如右图所示 激发光谱与发射光谱的关系i 波长比较与激发 或吸收 波长相比 荧光发射波长更长 即产生所谓Stokes位移 振动弛豫失活所致 ii 形状比较荧光光谱形状与激发波长无关 尽管分子受激到可到达不同能级的激发态 但由于去活化 内转换和振动弛豫 到第一电子激发态的速率或几率很大 好像是分子受激只到达第一激发态一样 换句话说 不管激发波长如何 电子都是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层 iii 镜像对称通常荧光光谱与吸收光谱呈镜像对称关系 蒽的荧光光谱和吸收光谱 解释 能层结构相似性荧光为第一电子激发单重态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层而形成 即其形状与基态振动能级分布有关 吸收光谱是由基态最低振动能层跃迁到第一电子激发单重态的各个振动能层而形成 即其形状与第一电子激发单重态的振动能级分布有关 由于激发态和基态的振动能层分布具有相似性 因而呈镜像对称 荧光 吸收 产生荧光的条件i 分子具有与辐射频率相应的荧光结构 内因 ii 吸收特征频率的光后 应可产生具一定量子效率的荧光 即量子效率 足够大 发射的光量子数 吸收的光量子数 1 跃迁类型 具有 及n 跃迁结构的分子才会产生荧光 且具 跃迁的量子效率比n 跃迁的要大得多 芳香属分子2 共轭效应 共轭度越大 荧光越强 平面环系统 绝大多数荧光物质含有芳香环或杂环 影响荧光及强度的因素 3 刚性结构 分子刚性 Rigidity 越强 分子振动少 与其它分子碰撞失活的机率下降 荧光量子效率提高 如荧光素 大 与酚酞 0 芴 1 与联苯 0 18 4 取代基 给电子取代基增强荧光 p 共轭 如 OH OR NH2 CN NR2等 吸电子基降低荧光 如 COOH C O NO2 NO X等 如苯环被卤素取代 从氟苯到碘苯 荧光逐渐减弱到消失 5 溶剂效应 溶剂极性可增加或降低荧光强度 改变 及n 跃迁的能量 与溶剂作用从而改变荧光物质结构来增加或降低荧光强度 6 温度 温度增加 荧光强度下降 因为内 外转换增加 粘度或 刚性 降低 因此体系降低温度可增加荧光分析灵敏度 7 pH值 具酸或碱性基团的有机物质 在不同pH值时 其结构可能发生变化 因而荧光强度将发生改变 对无机荧光物质 因pH值会影响其稳定性 因而也可使其荧光强度发生改变 8 荧光猝灭 碰撞猝灭 静态猝灭 转入三重态的猝灭 电子转移猝灭 自猝灭 测量过程 提供能量 光源 选择激发波长 吸收 照射样品样品吸收与发射荧光 发射 选择发射波长测量 激发光谱告诉我们什么 化合物吸收波长吸收强度溶剂吸收波长 激发光谱 发射光谱告诉我们什么 化合物荧光波长荧光强度拉曼和瑞利散射 发射光谱 哪些峰不是样品峰 瑞利散射激发波长峰发射和激发相同波长的峰拉曼散射溶剂发射波长 documented 与激发波长相差固定频率的波长2次或3次光发生在激发波长的2倍或3倍波长处 瑞利散射 颗粒的大小小于入射光的波长 光通过样品后频率不变 由于弹性碰撞不存在能量的转移 光线只是简单地改变方向 波长不变 粉末 悬浮液等样品 拉曼散射 样品吸收和发射光并伴随有能量转移的产生 光通过样品后光的波长 频率发生了改变 与入射光相比发射光的频率可能更高或者更低 瑞利 拉曼散射和2次光 瑞利散射峰350 拉曼峰397 2次光699792 外来峰的校正 截止滤光片去除2次 3次等高次光差谱法去除拉曼和瑞利散射峰用高纯溶剂 无荧光 扫描溶剂确定拉曼峰维持测定温度与条件 高通和带通滤光片套件 高通滤光片用于去除散射光 定量 荧光强度与浓度的关系 If 2 3 fI0 bc KCIf 荧光相对强度 f 量子效率I0 入射光强度 吸收系数b 光程长c 浓度 该式只有 bc 0 05时才成立 即荧光测定只有在极稀溶液中才可测定 否则校正曲线向浓度轴弯曲 标准表与标准曲线 荧光分光光度计原理和结构 荧光分光光度计示意图 发射单色器 PM PM 分束器 光源 激发单色器 光闸 样品池 光源 氙灯 高压汞灯 激光 样品池 石英 低荧光材料 两个单色器 选择激发光单色器 分离荧光单色器 两个检测器 光电倍增管 主要部件 RF 5301PC光路图 仪器性能 高水平灵敏度 蒸馏水的拉曼峰S N比为150以上 EX350nm 狭逢5nm 狭逢10nm拉曼峰S N 600 利用先进的直流式长驱动机构 可及为迅速的得到理想的光谱可进行高速光谱监控 最高扫描速度 波长范围 220 900nm及0次狭逢 1 5 3 5 10 15 20nm6档及激发6nm半高波长精度 1 5nm波长扫描速度Survey Super VeryFast Medium Slow VerySlow的7段转换 Survey 约5 500nm min Super约3 000nm min 仪器性能 功能强大 操作简便的软件系统 功能 激发光谱 荧光 同时光谱测定定量分析 次标准曲线 时间扫描 动力学 只需打开自动检索最佳激发光和荧光波长从瑞利散射 拉曼散射及 次光中自动判断出荧光使复杂的波长设置简单化 检索最佳的激发光和荧光波长 四则运算数据变换 1 4介导数 倒数 对数 曲线平滑峰值检测面积计算活度值计算等计算平均值 多样的数据处理 扩展功能和附件 大样品室可安装各种样品池架 流动样品池偏光装置等 丰富的任选附件 单一恒温样品池 带搅拌器 该部件在恒温状态下搅拌试样 进行测定 最适合浮游细胞的荧光测定 利用恒温水的循环 可使样品池恒温化 搅拌器的速度可调节 恒温水循环装置使用温度范围 室温 850C温度调节精确度 0 050C泵的流量 最大15L 18L min 50 60Hz 容器的容量 约6 8L 恒温四连池架利用恒温水的循环 一次可使4个样品池恒温化 适用的温度范围 50C 800C 微量样品池装置取400ul的少量试样就能测定 试样可以放入与四面研磨样品池大小 10mm 的槽中 安装在样品池架上进行测定 测定偏光的辅助装置 用于紫外可见光或只用于可见光 利用荧光偏光度的测定获得关于分子的大小 流动性及分子周围环境的信息 高灵敏度池架 固体 粉末 样品架固体 粉末样品 甚至样品池中的溶液也能用反射方式进行荧光测定 高台样品架 LC流动样品池 12ul 用于高速液相色谱分析的高灵敏度分光荧光监控 自由选择激发光波长和荧光波长 可进行有选择的检测 LC流动样品池 120ul 用于分析邻苯二酚胺 使用内容积120ul的散射光少的双面反射型石英微型的流动样品池 光电倍增管换用光电倍增管 可进行900nm以内的荧光光谱的测定 直径8mm的试管架可以安装试管 荧光应用领域 生命科学 氨基酸 缩氨酸 蛋白质 脂质 糖类 维生素 辅酶 胺类等 1 定性 定量 2 研究酶反应 分析研究基质 辅酶 蛋白质 色氨酸 3 对羟基苯基丙氨酸 的反应机理 3 抗原 抗体反应 4 研究蛋白质 蛋白质 核酸 蛋白质 糖 蛋白质的相互作用 5 利用荧光检验 Fura 2等 分析细胞内离子 Ca2 等 6 分析神经传递物质 苯邻二酚胺等 7 研究核酸 8 研究生物膜 荧光应用领域 食品科学 氨基酸 蛋白质 脂质 碳水化合物 维生素 辅酶 抗生物质 食品添加物 调味料 防酸化剂等 食物油 植物油 动物油 农药 氨基甲酸酯类 有机磷类 1 萘基醋酸 1 食品的成分分析 定量分析 2 残留农药的检测 荧光应用领域 化学 环境科学 各种有机化合物 无机化合物 高分子化合物 纤维 塑料 橡胶等 1 微量分析 2 物性研究 3 光化学反应研究 4 高分子聚合研究 5 光敏材料的研究 6 大气 水质 土壤的污染评估多环芳香烃类 7 原油 煤的分析 样品形态 液体CellsuspensionsTransparen