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第十六章抗生素类药物分析 1 第一节概述 2 一 抗生素的定义及特点 低化学纯度 同系物多 异构体多 降解物多 活性组分的变异性 生产过程中条件的变化 不稳定性 不稳定性结构 是指 生物在其生命活动中产生的 能在低微浓度下有选择地抑制或影响它种生物机能的化学物质的总称 3 抗生素的分类 内酰胺类抗生素四环素类抗生素氨基糖苷类抗生素大环内酯类抗生素多烯大环类抗生素 制菌霉素 两性霉素多肽类抗生素 放线菌素 多黏菌素酰胺醇类抗生素 氯霉素抗肿瘤类抗生素其他抗生素 二 抗生素类药物的分类按化学结构分 4 三 抗生素类药物的细菌耐药性 5 6 7 8 三 抗生素类药物的细菌耐药性 1 耐药性的种类固有耐药性 天然耐药性 由细菌染色体基因决定获得性耐药性 2 耐药的机制 1 产生灭活酶 使抗菌药失活如 内酰胺酶 2 抗菌药物作用靶位改变 3 降低细菌外膜通透性 4 影响主动流出系统 9 10 四 抗生素药物的质量分析 鉴别试验 1 官能团的显色反应 特殊基团的反应2 光谱法 特征吸收3 色谱法 保留行为4 生物学方法 抗菌能力 11 检查 1 影响产品稳定性的检查项目 水份 酸碱度等2 控制有机和无机杂质的检查项目3 与临床安全性密切相关的检查项目 异常毒性 热原等4 其他检查项目 其他共存组分 12 含量或效价测定 1 微生物检定法比浊法管碟琼脂扩散法 抑菌圈 Potency 是指每ml或每mg中含有某种抗生素有效成分的多少U mg 是以抗生素对微生物的杀伤或抑制程度为指标来判断效价的一种方法 方法 13 灵敏度高 需用量少适用范围广 纯品 不纯品 已知的和新的可一次测定同类型抗生素的总效价 无需分离纯化与临床的应用要求一致操作繁琐 费时费力误差较大 是结构复杂和多组分抗生素效价测定的首先方法 优点 含量或效价测定 1 微生物检定法 缺点 14 2 物理化学法HPLCLC MSUV容量法准确可靠 专属性高 操作简单 省时 样品用量少 1 对结构已知或提纯的抗生素2 需要标准品对照 仪器分析方法 含量或效价测定 15 第二节 内酰胺类抗生素 16 内酰胺类抗生素 6 氨基青霉烷酸 6 APA 青霉素类 7 氨基头孢菌烷酸 7 ACA 头孢菌素类 一 结构及分类 氢化噻嗪环 氢化噻唑环 17 青霉素 青霉素钾 钠 18 氨苄西林 氨苄青霉素 19 阿莫西林 羟氨苄青霉素 20 普鲁卡因青霉素 21 头孢氨苄 22 头孢羟氨苄 23 理化性质 1 酸性与溶解性2 旋光性3 紫外吸收特性4 不稳定性 24 酸性 一 结构特点与性质 与碱金属 Na K 成盐 一 羧基 易溶于水 25 与有机碱 普鲁卡因 成盐 难溶于水 普鲁卡因青霉素 26 二 手性C 头孢菌素类C6C7 青霉素类C3C5C6 旋光性 27 三 共轭体系 青霉素类母核无明显UV多数有苯环取代基 UV 28 四 内酰胺环的不稳定性 水溶液不稳定 干燥纯净稳定 不稳定性因素 四元环张力大 酰胺键易水解 含水量纯度 29 四 内酰胺环 30 与含水量和纯度密切相关 青霉素的降解途径 31 青霉素的降解产物 青霉噻唑酸 青霉素酶青霉酸 强酸性环境青霉烯酸 弱酸性环境青霉醛 强酸性 加热青霉胺 强酸性 加热 青霉素酶 重金属 降解产物 32 二 鉴别反应 一 显色反应 1 异羟肟酸铁反应 33 2 茚三酮反应 氨基 蓝紫色 34 3 双缩脲反应 似肽键 紫 35 36 4 与重氮苯磺酸反应 橙黄色 重氮苯磺酸 5 6 OH H C 偶合 酚羟基 头孢哌酮 37 1 K Na 的火焰反应 二 各种盐的反应 38 2 沉淀反应 青霉素盐 遇酸 在过量HCl或有机溶剂中溶解 白 青霉素 青霉素钠 青霉素钾 H 39 3 重氮化 偶合反应 重氮化 偶合反应 芳伯氨基 40 样品 分解产物 Cu2 41 42 2 IR法 3180cm 1 N H 内酰胺 C O 1780cm 1 3470cm 1 O H 1690cm 1仲酰胺 C O 1250cm 1 C O 以阿莫西林为例 43 对照品对照法 44 三 杂质检查 药物检查项目检查方法头孢他啶聚合物HPLC法头孢曲松钠头孢哌酮钠头孢噻肟钠头孢呋辛酯有关物质和异构体HPLC法头孢氨苄有关物质反相TLC法青霉素钾 钠 吸收度紫外分光光度法 45 1 头孢他啶聚合物的测定分子排阻色谱法固定相 葡聚糖凝胶G 10流动相A 3 5 硫酸铵的0 01mol L磷酸盐缓冲液流动相B 0 01 十二烷基硫酸钠对照品溶液 头孢他啶对照品100 g ml 46 1 系统适用性试验 理论塔板数和拖尾因子用1mg ml蓝色葡聚糖2000 流动相A测定 重复性用对照品溶液 流动相B测定 N不低于900 拖尾因子0 75 1 5 峰面积的RSD应小于5 0 2 测定方法进样供试液 用流动相A 进样对照液 用流动相B 以外标法计算 含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得超过0 3 47 2 头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查固定相 ODS流动相 0 2mol L磷酸二氢铵 甲醇 62 38 1 头孢呋辛酯 2 异构体的制备 头孢呋辛酯对照品 流动相头孢呋辛酯 2 异构体 2 系统适用性试验 各异构体之间的R 1 5 以头孢呋辛酯A异构体计算n 1500 48 3 异构体 相对保留时间1 被测物2 标准物异构体相对保留时间判断B异构体0 85供试液谱图中A异构体的峰面积A异构体1 0与A B异构体峰面积和之比应为0 48 0 55 异构体A 异构体B 头孢呋辛 49 3 头孢氨苄中有关物质的检查 反相TLC法固定相 活化后的硅胶G板置5 V V 正十四烷的正己烷溶液中 展至顶部 凉干展开剂 0 1mol L枸橼酸 0 2mol L磷酸氢二钠 丙酮 120 80 3 供试液 本品50mg ml对照液 1 本品0 5mg ml对照液 2 苯甘氨酸0 5mg ml对照液 3 7 氨基去乙酰氧基头孢烷酸0 5mg ml 50 结果判断 供试液如显杂质斑点 与对照液 2 3 位置相同上所的斑点比较 其颜色不得更深 如显其他杂质斑点 与对照液 1 所显的主斑点比较 其颜色不得更深 51 4 青霉素钠 钾 的吸收度检查 供试液1 80mg ml 结果判断 A280不得大于0 10 52 一 高效液相色谱法原理 利用青霉素类抗生素在一定条件下在反相硅胶上的保留行为的不同而实现高效分离 并与标准品相对照 而对其进行定量的一种方法 优化色谱分析条件 1 Column CNODSC18C8 Ben 2 mobilephase flowrate 3 columntemperature 4 detectionwavelength 5 workstationsamplepreparation 四 含量测定 容量法和仪器分析法 53 实验注意事项 1 色谱峰要达到较好的分离 基线分离 baseseparation 2 需要标准品对照 用外标法定量 3 可同时测定多个组分的含量 4 需要排除制剂中辅料等杂质对测定的干扰 54 二 生物样本中 内酰胺类抗生素的分析 血浆尿样唾液胆汁 生物样本 色谱柱 HypersilODSC18 200mm 4 6mm I D 5 m 样品制备 取血浆200 L 加入内标5 L 再加入HCLO4 窝旋提取 InternalstandardIS 55 56 第三节氨基糖苷类抗生素 57 第三节氨基糖苷类抗生素 链霉素双氢链霉素新霉素卡那霉素庆大霉素巴龙霉素 58 链霉胍 链霉糖 N 甲基 L 葡萄糖胺 59 链霉素 链霉胍 链霉糖 N 甲基 L 葡萄糖胺 60 D 葡萄糖胺 脱氧链霉胺 D 核糖 巴龙霉糖 巴龙胺 巴龙二糖胺 61 绛红糖胺 脱氧链霉胺 加洛糖胺 62 绛红糖胺 紫素胺 2 脱氧链霉胺 加洛糖胺 N 甲基 3 去氧 4 甲基戊糖胺 63 庆大霉素C复合物庆大霉素C1R HR1 R2 CH3庆大霉素C2R R2 HR1 CH3庆大霉素C1aR R1 R2 H庆大霉素C2aR CH3R1 R2 H庆大霉素C2bR R1 HR2 CH3 64 多与硫酸成盐 碱性 一 65 链霉素pH5 7 5庆大霉素pH2 12 66 67 羟基胺结构 68 2 Molisch反应具有五碳糖或六碳糖的氨基糖苷类抗生素经酸水解后 在盐酸作用下脱水生成糠醛或羟甲基糠醛 加入 萘酚 红紫色 或蒽酮 蓝紫色 69 红紫色 70 3 Elson Morgan反应水解产生的N 甲基 L 葡萄糖胺在碱性溶液中与乙酰丙酮合成吡咯衍生物 再与对二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液反应 生成樱桃红色缩合物 蓝紫色 71 4 麦芽酚反应 链霉素的特征反应链霉素水解得到的链霉糖经分子重排使环扩大形成六元环 然后消除N 甲基葡萄糖胺 再消除链霉胍 生成 甲基 羟基 吡喃酮 麦芽酚 该化合物与Fe3 在弱酸性溶液中形成红紫色配位化合物 72 紫红 麦芽酚 73 5 坂口反应 链霉胍的特有反应向链霉素的水解产物链霉胍与NaBrO2反应得产物1 8 羟基喹啉也和NaBrO2反应得产物2 产物1和产物2再相互作用生成橙红色化合物 74 八 色谱法 1 TLC法 硫酸庆大霉素的鉴别点样 供试液 展开 凉干 碘蒸气中显色对照液判断 供试液与对照液所显斑点的颜色与位置应一致 点样 供试液对照液 硫酸链霉素标准品对照液 硫酸链霉素标准品 硫酸新霉素标准品 硫酸卡那霉素标准品 75 判定法 供试液中主斑点的位置 颜色 大小应与对照液 相同 对照液 应显示分离清晰的3个斑点否则试验无效 2 HPLC法 硫酸庆大霉素的鉴别比较供试液与对照液各组分的保留时间 76 特殊杂质的检查 1 链霉素中链霉素B的检查 TLC法硅胶G板 使用前需活化 展开剂甲苯 冰乙酸 甲醇 50 25 25 0 2 二羟萘的乙醇 20 硫酸混合液 2 庆大霉素中组分C的检查 衍生化后HPLC色谱柱 流动相 检测波长 衍生化条件的摸索组分C的毒副作用和耐药性与庆大霉素有差异 导致产品的效价和临床疗效 77 4 10 pH 吲哚衍生物 巯基醋酸 邻苯二醛 氨基 max 330nm 衍生化原理 1 78 1 烷基硫代 2 烷基异吲哚衍生物 79 RP HPLC 规定C125 50 C1a15 40 C2a C220 50 峰面积归一化法 80 81 微生物检定法各国药典主要采用 HPLC法常用于体内药分 返回 82 第四部分 四环素类抗生素 TrtracyclinesTC 83 理化特性 1 酸碱两性 C4 二甲氨基 C10 酚羟基 2 旋光性 含有手性中心 一般为左旋 3 紫外吸收特性 具有共轭双键体系 吸收波长为长波方向 4 与金属离子的配位化合物反应 酚羟基和烯醇基 5 不稳定性 对各种外界条件 包括氧化剂 酸 碱 易形成差向 脱水和异四环素 颜色加深 84 弱酸性环境 ETC 差向四环素 85 强酸性环境 ATC 脱水四环素 86 碱性环境 EATC 异四环素差向脱水四环素 87 88 89 盐酸土霉素的鉴别 EDTA克服痕量金属造成的拖尾现象 比较保留时间 90 三 特殊杂质检查 4 差向四环素 ETC 脱水四环素 ATC 差向脱水四环素 EATC 盐酸金霉素 CTC HPLC法 2000版 盐酸四环素 91 四环素有关物质TLC图 4 0 5 0 5 2 92 nm max 355 268 l 盐酸四环素 93 杂质吸收度 取供试品配成每10mg ml的溶液至4cm的吸收池中 在530nm处测定 其吸收度不得超过0 12 应严格控制温度和时间 94 HPLC法 盐酸四环素的测定系统适用性试验 盐酸四环素 有关物质及ATC峰间的分离度均应符合要求 定量方法 外标法以峰面积计 95 第五节抗生素类药物中高分子杂质的检查 1 高分子杂质分子量大于药物本身的杂质总称 96 蛋白 多肽 多糖或抗生素与蛋白 多肽 多糖的结合物 主要来自于发酵工艺 致敏 如青霉噻唑蛋白 青霉噻唑多肽 药物的自身聚合物 来自于生产 贮存过程 可引发过敏 外源性杂质 内源性杂质 97 2 基本特点 对青霉素而言 青霉噻唑多肽 外源性的 2400 3500 青霉素聚合物 内源性的 聚合度 母核参与的聚合反应 N型聚合反应侧链参与的聚合反应 L型聚合反应 分类 98 1 生产过程中的任何蛋白或碎片都可带入产品中 易与药物形成多肽类杂质 2 形成的聚合物也可发生不同程度的降解 3 异构体之间可以相互聚合 L L D D L D 4 高分子杂质与生产工艺密切相关 特点 99 高分子杂质的控制方法 1 高效液相色谱法 2 凝胶色谱 自身对照外标法SephadexG 10 3 离子交换色谱 凝胶色谱法 利用凝胶的分子筛作用 让药物分子自由的进入到凝胶颗粒内部 而高分子杂质被排阻的原理进行的 故此大分子则先流出色谱柱 小分子后出峰而得以分离 100 高分子杂质的分析方法 1 蓝色葡聚糖在高分子分离中的N 2500 m 拖尾因子0 75 1 5 2 峰面积的RSD 5 色谱适用性条件 HPLC系统简单测定系统 分析方法 101 练习与思考 A型题 1 硫酸链霉素 硫酸青大霉素的鉴别方法是A 三氯化铁反应B 硫色素反应C 茚三酮反应D 与碱性酒石酸铜试液反应E 双缩脲反应 102 2 青霉素钠 中国药典 规定的含量测定方法为A 非水溶液滴定法B 旋光法C HPLC法D 紫外分光法E 汞