MiRNA与转录后调控ppt课件.ppt

转录后调控 microRNA的研究进展 分子遗传毒理实验室 1 Outlines 引言miRNA简介miRNA功能miRNA的研究方法miRNAandSNPs 2 基因组转录组蛋白组 ThestudyofproteinsexpressedbygenomesCompletionofthesequencingofthe1stdraftofhumangenomeindicatesthereareapproximately250 000proteinsinthehumangenomeOnly2 5 ofproteinsinhumangenomehavebeenidentified 3 转录transcriptions 转录是指DNA指导的RNA合成 反应是以DNA为模板 在RNA聚合酶催化下 以四种三磷酸核苷 NTP 即ATP GTP CTP及UTP为原料 各种核苷酸之间的3 5 磷酸二酯键相连进行的聚合反应 合成反应的方向为5 3 转录作用过程可以分为三个阶段 起始 延长及终止 4 转录后的调控regulations 转录作用产生出的mRNA tRNA rRNA及小分子RNA的初级转录本全是前体RNA 而不是成熟的RNA 它们没有生物学活性 还要在酶的作用下 进行加工才能变为成熟的 有活性的RNA 调控方式 1 5 末端帽子的生成2 3 末端多聚A尾的生成3 剪接作用4 RNA编辑5 甲基化修饰6 microRNA 5 真核生物mRNA的一般结构structures 6 一些基因组中蛋白编码部分与非编码部分的比例生物基因组长度蛋白编码部分非编码部分基因数 kbp 真细菌U urelyticum7518812577E coli4 63984164 000M leprae3 26873272 584古细菌P horikoshii1 73987131 636M jannaschii1 66583171 599S solfataricus2 99277232 610真核生物E cuniculi2 90090102 000S cerevisae12 00071295 651S pombe12 46357434 824A thaliana115 410297125 500C elegans97 000277318 424D melanogaster180 000138713 600H sapiens3 000 00029824 500 7 CodingRNAmRNA中的编码区 ORF Non codingRNA ncRNA 除ORF以外的所有RNA品种和片段 RNA的分类 8 ncRNA的数量 反转座子基因占基因组的45 可变剪接占多外显子基因的41 60 反向转录的占基因总数的10 20 最新估计的蛋白质基因数为24500个 占基因组的约1 5 9 1998年109次香山会议中国科学家提出了RNA组计划 10 PNAS December19 2000vol97no 2614035 14037 11 RNomics的内涵 研究所有以RNA为终产物基因的时空表达谱和其生物学含义 12 欧美已启动以非编码RNA为主要目标的科学计划 欧盟的 RNA调控网络与健康和疾病 计划 RNAinhealthanddisease Ribonet 美国国家人类基因研究所提出 DNA百科全书 计划 EncyclopediaofDNAelements 中国的 调控RNA与人类疾病 973计划 屈良鹄 中国的 表观遗传学 973计划 裴钢 13 I MicroRNA简介 1 长度为21nt左右核苷酸的内源性单链小分子RNA 2 存在65nt左右的发夹结构前体 3 基因座位在蛋白质基因间隔区 4 其DNA序列在近源物种间高度保守 miRNA具有十分重要的调控功能 它们主要参与基因转录后水平的调控 能够通过与靶mRNA特异性的碱基配对引起靶mRNA的降解 植物中较为常见 或者抑制其翻译 动物中较为常见 从而影响了靶mRNA的表达 目前发现miRNA是一个庞大的小分子调控RNA家族 广泛存在于各种动植物中 参与细胞增殖和分化 细胞凋亡 胚胎发育 形态建成以及疾病发生等一系列重要的生命过程 最近发现一系列与肿瘤发生相关的和人类病毒编码的miRNA 揭示miRNA在哺乳动物基因表达调控中具有重要作用 14 microRNA的发现与发展 1993年 Dr VictorR Ambros在线虫中发现了第一个miRNAlin4 与线虫的发育相关 Cell75 843 1993 2001年 在线虫 果蝇和人cDNA文库中鉴定出96种与lin 4和let 7相似的长度约为21 22nt的非编码小分子RNA Science294 853 864 2001 microRNA首先在线虫中发现 9年后发现在多种生物中发挥基因调控作用 引起科学界广泛关注 Nature420 732 2002 2002年 MicroRNA赢得Science杂志评选的十大科技突破第一名 Science298 2296 2002 至2005年9月 在动物 植物 病毒中已鉴定出miRNA共2909个http www sanger ac uk Software Rfam mirna 15 16 计算机预测各种生物中miRNA基因的数目 计算机预测各种生物中miRNA靶基因的数目 17 miRNAs的重要特点 时序特异性与组织特异性 斑马鱼胚胎发育过程中90种miRNAs的表达谱 microarray miRNAs在受精后早期一直到卵裂开始 12hpf 并不表达 受精后一天陆续表达 直到器官发生基本完成 96hpf 大多数miRNAs的表达达到最高峰 Science309 5732 310 311 2005 哺乳动物miRNAs的组织特异性Nat Rev Genet 5 7 522 31 2004 18 II miRNA的表达及作用机制 Lin 4和let 7 由前体加工而来 成熟分子通过与各自靶基因lin 14和lin 41mRNA3 UTR不完全反义互补 抑制lin 14和lin 41mRNA的翻译 2001年 发现RNAi中siRNA的成熟酶Dicer也是lin 4和let 7形成所必需 提示RNAi和miRNA途径存在交叉 2002年 发现拟南芥的miRNA 39与靶基因mRNAs完全互补 并导致mRNAs在互补区中间切断 提示miRNA功能只取决于它与靶mRNA3 UTR之间的互补程度 2003年 发现pre rRNA 核糖体RNA 的形成过程中的一类RNaseIII类核酸酶Drosha负责pri miRNAs的加工 2003年 发现pre miRNA的出核运输依赖于Exportin 5 2004年 发现pri miRNAs末端有poly A 尾 注入alphaamanitin 蝇蕈素 使人类细胞的pri miRNAs水平剧减 提示miRNAs基因由RNApolymeraseII转录 19 1 miRNA基因在染色体上的分布 MolecularCell16 6 2004 20 Nat Rev Genet 5 7 522 31 2004 2 miRNAs的发生和作用机制模型 21 2 miRNAs的发生和作用机制模型 1 核内由RNApolymeraseII转录pri miRNAs 由Drosha加工为pre miRNAs 2 pre miRNAs由Exportin 5在Ran GTP存在下转运出核 3 细胞质中由Dicer剪切加工 后解链成熟为miRNAs 4 miRNAs与多种蛋白结合 形成RNA介导的沉默复合体 RISC 作用于靶基mRNA的3 UTR 如果miRNA与3 UTR存在完全互补 则导致mRNA切断降解 如果互补程度不高 则引起靶mRNA翻译抑制 Nat Rev Genet 5 7 522 31 2004 22 23 Cell118 1 2004 3 RNaseIII的作用特点 24 第一种以线虫lin 4为代表 作用时与靶基因不完全互补结合 进而阻遏翻译而不影响mRNA的稳定性 这种miRNA是目前发现最多的种类 第二种以拟南芥miR 171为代表 作用时与靶标基因完全互补结合 作用方式和功能与siRNA非常类似 最后切割靶mRNA 这说明某些miRNA和siRNA一样参与了机体内一些特异性mRNA的剪切过程 第三种以let 7为代表 它具有以上两种作用模式 当与靶基因完全互补结合时 直接靶向切割mRNA 如果蝇和Hela细胞中let 7直接介导RISC分裂切割靶mRNA 当与靶标基因不完全互补结合时 起调节基因表达的作用 如线虫中的let 7与靶mRNA3 端非翻译区不完全配对结合后 阻遏调节基因的翻译 第四种作用时与靶基因3 非翻译区结合 进而影响mRNA的稳定性 4 miRNA对靶基因的作用模式 25 III miRNA的功能 随着越来越多miRNA的发现 除了lin 4和let 7在线虫的发育过程中的时序控制作用外 人们发现其它生物的多种多样的生物学现象和生理过程与之息息相关 特别是在胚胎发育 细胞分化 以及肿瘤发生方面尤为突出 26 Nature426 6968 845 849 2003 Nature430 7001 785 789 2004 1 miRNAs在线虫嗅觉神经细胞分化过程中的作用 线虫嗅觉感受器 ASE 功能上都是不对称的 左侧和右侧分别感受不同的化学信号 功能的不对称是由于gcy 7只在左侧表达 而gcy 5只在右侧的表达 gcy guanylyl环化酶受体 gcy不对称表达是由mir 273 lsy 6的不对称表达决定 27 Cell121 7 1097 1108 2005 28 miR 1Hand2proteinHand2mRNAProliferation growth time Nature436 7048 214 220 2005 2 miRNAs在小鼠心脏发育中的作用 miR 1在心脏形态建成中的作用示意图 发育晚期的小鼠心脏剖面图示过表达miR 1抑制正常的细胞增殖 使心肌壁薄而松 29 Neuron46 3 363 367 2005 3 1miRNAs在胚胎干细胞发育分化中的作用模式图 proliferation stemcellmaintenance differentiation cell typespecific miRNA在特异的时间表达 通过关闭特异蛋白质基因的表达 促进胚胎发育过程中一些事件的适时启动或关闭 保证正常的发育的进行 30 3 2miRNA调控造血干细胞的分化 3种miRNA控制造血干细胞向淋巴细胞的分化过程 Science303 5654 83 86 2004 31 Northern杂交确定了miR 375在INS 1细胞的表达 miR 375在部分糖尿病模型NOD小鼠的异常高表达 阳性率 60 反义2 O 甲基化寡核苷酸技术 特异性抑制miR 375 不同浓度葡萄糖刺激经2 O me eGFP 375 处理后INS 1细胞胰岛素的分泌 Mtpn在INS 1细胞 正常小鼠和NOD小鼠的差异表达 32 4 miRNA基因异常与肿瘤发生相关 人类52 的miRNAs定位在染色体的脆性位点 FRAs 61个miRs和FRAs定位在同一染色体带 红色星表示 红色箭头表示癌症病例中观察到的频率较高的FRAs PNAS101 9 2999 3004 2004 人核型图显示113个FRAs和186miRs的位置关系 33 某些定位在染色体的脆性位点 FRAs 的miRNAs与肿瘤的发生有关 PNAS101 9 2999 3004 2004 34 Nature435 7043 834 838 2005 microarray显示肿瘤和正常组织中129种miRNA的表达水平 众多肿瘤miRNA整体表达水平下降 35 let 7与肺癌的关系 正常肺组织中let 7非常丰富 但肺癌中let 7表达水平普遍下降 人RAS是let 7的靶基因 体外证实let 7抑制肺癌细胞系的增殖 肺癌组织中let 7表达不足 RAS过度表达 癌细胞增殖迅速 Cell120 5 635 647 2005 N Engl J Med 352 23 2446 2448 2005 36 Nature435 7043 828 833 2005 淋巴癌中miR 17 92簇的表达水平 转miR 17 92簇小鼠迅速诱发全身癌变 小鼠死亡加快 miR 17 92簇可能是一种新的癌基因 37 NatureMed11 7 713 714 2005 a miRNA过度表达 抑制了抑癌基因的正常表达 b miRNA表达过少或缺失 不能有效抑制癌基因 microRNAs通过对抑癌基因和 或癌基因的调控与肿瘤的发生相关 38 动物中miRNA的功能 39 IV miRNA的研究方法 miRNA的寻找技术 miRNA的检测技术 miRNA功能的研究技术 40 1 miRNA基因的寻找 克隆构建smallRNA库 进行筛选 电脑模拟进行同源性搜索 41 MicroRNA基因确认的基本原则 A 能够通过与特定大小的总RNA样品杂交得到 22nt的产物 即需要Northern杂交或引物延伸反应验证表达 B 所得的序列是从特定大小的 22nt 的小分子RNA库中克隆到的 并且必需与克隆的来源物种的基因组序列完全匹配C 经过前体的二级结构预测 有发夹状的二级结构 并且成熟的miRNA序列在发夹的一条臂上D 成熟的miRNA序列与预测的二级结构在不同物种间有保守性E 在Dicer突变的系统中 前体的积累增多 理想的 A D E 充分的 A D 必要的 A CorB D RNA9 277 279 2003 42 克隆建库寻找新的miRNA基因 43 44 克隆到的miRNAs经过杂交验证其表达 45 Science299 2003 电脑进行同源性比对寻找新的miRNA基因 46 2 miRNA的检测技术 芯片技术Microarray 原位杂交 其它方法 47 应用芯片技术高通量的检测不同样品中多种miRNA的表达量的差异 NAR33 2 2005 48 NAR33 2 2005 49 Science309 5732 310 311 2005 原位杂交技术可以方便的检测miRNA的时空表达的差异 50 3 miRNA的功能的研究方法 高表达miRNA 转基因 在体内抑制miRNAs的表达 51 PLoSBIOLOGY2 4 E98 2004 通过对miRNA的合成及功能行使过程所必需的蛋白复合物进行抑制从而降低miRNA的表达 在体内使miRNA的表达量下调 2 O 甲基修饰的与let7互补的寡核苷酸的导入可以使let7丧失功能 是由于这种带修饰的寡核苷酸的结合封闭了RISK复合体 52 Nature423 2003 针对miRNA的前体的发夹结构设计siRNA降低miRNA的表达量 53 Curr Opin Chem Biol 7 4 516 523 2003 1 染色体重塑2 DNA甲基化3 转录4 RNA加工5 RNA稳定性6 RNA转运7 RNA定位8 翻译9 蛋白质活性10 miRNA稳定性 miRNAs可能参与各种基因表达过程的调控 54 V miRNAandSNPs 55 FunctionalanalysisofSNPs Promoter Intron Exon2 Exon1 5 UTR 3 UTR Functionsofdifferentelementsabove Promoter Transcription5 UTR TranscriptionandtranslationCodingregion Functionandactivityofenzymes TranslationefficiencyIntron Alternativesplicing3 UTR mRNAStability mRNAlocationandtranslation 56 AssociationstudyofMDM2 234bladdercancercases 253controls 5outof18tagSNPsarepositive PC P 0 01 mRNA 5 UTR Codingregion 3 UTR 57 microRNAtargetprediction microRNAprediction Basedon seedsequence PicTar http pictar bio nyu edu Targetscan http www targetscan org 58 SNPT C PutativemicroRNAsHas mir 25 32 92 323 367 Targetscan http www targetscan org 59