蛋白酶活性的测定方法及原理.pptx

蛋白酶活性的测定方法及原理 罗老师 组员 宁舒婷 陈丽君 陈海梅 王熙栋 各种测定方法及原理 考马斯亮蓝法 甲醛滴定法 DHT 酪蛋白法 DNA 溴乙锭荧光分析法 X 光胶片法 福林酚法 甲醛滴定法 3 考马斯亮蓝染料与蛋白质在酸性条件下结合 主要是染料与蛋白质中的碱性氨基酸 特别是精氨酸 和芳香族氨基酸残基相结合 使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm 溶液的颜色也由棕黑色变为兰色 在595nm下测定的吸光度值A595 与蛋白质浓度成正比 考马斯亮蓝法 4 蛋白酶催化蛋白质水解成氨基酸 再用甲醛固定氨基酸的氨基 用0 1mol LNaOH溶液滴定生成的氨基酸 从而测定其酶活 考马斯亮蓝法 甲醛滴定法 5 用5 氨基四唑重氮盐将氨基酸中部分组氨酸和酪氨酸重氮化 得到黄色的重氮5 氨基四唑酪蛋白 DHT 酪蛋白 以DHT 酪蛋白为底物 在蛋白酶作用下 水解生成DHT 肽 二价离子可与DHT 蛋白与DHT 肽形成稳定的可溶性红色螯合物 而锌离子可迅速沉淀DHT 酪蛋白 但不沉淀DHT 肽 选用合适浓度的锌离子和镍离子作为沉淀剂和显色剂 利用比色法可测定蛋白酶酶活 考马斯亮蓝法 DHT 酪蛋白法 6 溴乙锭插入双链DNA的碱基对之间时 可使DNA的荧光增加25倍 接近饱和的溴乙锭 0 5 g mL 与DNA混合时 其荧光增加量与DNA的浓度呈正比 在DNA 组蛋白 溴乙锭溶液中加入蛋白酶时 蛋白酶水解结合在DNA链上的组蛋白 使DNA结合部位暴露出来 溴乙锭重新插入DNA双链中 荧光增加量与蛋白酶活性呈正比 通过测定DNA溶液的荧光增量来计算蛋白酶的活性 考马斯亮蓝法 DNA 溴乙锭荧光分析法 7 酶的底物明胶涂抹在X 光胶片上 当待测酶液滴加到X 光胶片上时 酶将X 光胶片上的明胶水解 用水冲洗胶片 即可看到胶片上明胶被酶水解的地方 出现透明的圆圈 酶活性的高低与透明圆圈的面积成正比 测定圆圈的面积以测定蛋白酶的活性 考马斯亮蓝法 X 光胶片法 8 福林 酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色钼蓝和钨蓝混合物 而蛋白质分子中有含酚基的氨基酸如酪氨酸 色氨酸等 可使蛋白质及其水解产物呈上述反应 利用此原理测定蛋白酶酶活 考马斯亮蓝法 福林酚法 福林酚法测定蛋白酶活性 蛋白酶对酪蛋白 乳清蛋白 谷物蛋白等都有很好的水解作用 磷钨酸和磷钼酸混合试剂 即福林 酚试剂 碱性条件下极不稳定 易被酚类化合物还原而呈蓝色反应 钨兰和钨兰混合物 由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸 酪氨酸 色氨酸 苯丙氨酸 因此 蛋白质及其水解产物也呈此反应 利用蛋白酶分解酪素 底物 生成含酚基氨基酸的呈色反应 来间接测定蛋白酶的活力 分析天平 精度0 0001g恒温水浴 精度 0 2 计时表分光光度计沸水浴器振荡混合器pH计 精度0 01pH单位乳酸缓冲液 pH 3 0 适用于酸性蛋白酶磷酸缓冲液 pH 7 5 适用于中性蛋白酶硼酸缓冲液 pH 10 5 适用于碱性蛋白酶0 4mol L碳酸钠溶液0 4mol L的三氯醋酸液0 5mol L的NaOH10 00mg ml酪素溶液100 g ml酪氨酸标准溶液 标准曲线的绘制 L 酪氨酸标准溶液按下表配制 分别取上述溶液各1 00ml 须做平行试验 各加入0 4mol L碳酸钠溶液5 00ml 福林试剂使用溶液1 00ml 置于40 0 2 水浴中显色20min 取出用分光光度计于波长680nm 比色 以不含酪氨酸的0管为空白管调零点 分别测定其吸光度值 以吸光度值为纵坐标 酪氨酸的浓度为横坐标 绘制标准曲线或计算回归方程 计算出当OD为1时的酪氨酸的量 g 即为吸光常数K值 其K值应在95 100范围内 实验步骤 蛋白酶活性的计算 K 吸光常数 Title 1g固体酶粉 或1ml液体酶 在40 酸性pH 3 0 中性pH 7 5 碱性pH 10 5 条件下 1min水解酪素产生1 g酪氨酸为一个酶活力单位 蛋白酶的活力 A K 4 10 nU g ml A 样品平行试验的平均OD值 K 吸光常数 4 反应试剂的总体积0 酶解反应时间n 酶液稀释总倍数 1 思考题 Title 蛋白酶有哪几类 按蛋白酶水解蛋白质的方式 A内肽酶 切开蛋白质分子内部肽键 生成相对分子质量较小的多肽类 B外肽酶 切开蛋白质或多肽分子氨基或羧基末端的肽键 而游离出氨基酸的酶类 C水解蛋白质或多肽的酯键 D水解蛋白质或多肽的酰胺键 按酶的来源可分为 动物蛋白酶 植物蛋白酶 微生物蛋白酶 微生物蛋白酶又可分为 细菌蛋白酶 霉菌蛋白酶 酵母蛋白酶和放线菌蛋白酶 按蛋白酶作用的最适PH可以分为 A PH2 5 5 0的酸性蛋白酶 B PH9 5 10 5的碱性蛋白酶 C PH7 8的中性蛋白酶 影响酶活力的因素有哪些 酶浓度对酶活力的影响 酶促反应速率与酶分子的浓度呈正比 在一定范围内 当底物分子浓度足够时 酶分子越多 底物转化的速度越快 底物浓度对酶活力的影响 若酶的浓度为定值 底物的起始浓度越低时 酶促反应速度与底物浓度呈正比 即随底物浓度的增加而增加 当所有的酶与底物结合生成中间产物后 即使再增加底物浓度 中间产物浓度也不会增加 酶促反应速度也不会增加 温度对酶活力的影响 在适宜的温度范围内 酶促反应速度随温度升高而增加 超过最适反应温度 酶活力将会下降 PH对酶活力的影响 酶在最适PH范围内表现出活性 大于或小于最适PH 都会降低酶活性 激活剂对酶活力的影响 某些无机阳离子 阴离子 有机化合物可作为激活剂 能够激活酶 使其表现出催化活性或强化其催化活性 抑制剂对酶活力的影响 酶的抑制剂能够减弱 抑制甚至破坏酶的活力 它可降低酶促反应速度 使用紫外分光光度计时应注意哪些问题 使用的比色皿必须洁净 并注意配对使用 手指应拿毛玻璃面的两侧 装盛样品