生物化学 核酸生物化学.ppt

第二章 核酸的化学 本章主要内容核苷酸DNARNA核酸的性质 认识核酸在生命科学上的重要性弄清碱基 核苷 核苷酸和核酸分子结构上的关系掌握核酸的化学本质及DNA和RNA在组分 结构和功能上的差异认识核酸的结构与其性质与功能之间的关系 学习要求 1869年F Miescher首先从伤员绷带的脓细胞中分离得到称为 核素 的核酸1944年O N Avery通过转化实验证实DNA是主要的遗传物质1953年J D Watson和F H C Crick提出DNA双螺旋结构模型1958年Crick提出遗传信息传递的中心法则1970年 建立DNA重组技术1980年后 分子生物学 分子遗传学等学科突飞猛进发展 提出并完成HGP 核酸化学的发展过程 一 概述概念 核酸 nucleicacid 是由碱基 嘌呤和嘧啶 戊糖和磷酸组成的高分子物质 是生物体的基本组成 种类 DNA 脱氧核糖核酸 RNA 核糖核酸 四核苷酸假说 核酸由四种核苷酸组成的单体构成的 缺乏结构方面的多样性 不大可能有重要的生理功能 1944年 Avery等人的肺炎双球菌转化实验证实核酸是生命遗传的基础物质 1952年 Hershey和Chase的T2噬菌体侵染实验彻底证明遗传物质是核酸 而不是蛋白质 1928年 英国S型肺炎球菌 有荚膜 菌落表面光滑R型肺炎球菌 没有荚膜 菌落表面粗糙 著名的肺炎球菌实验 结果说明 结果说明 加热杀死的S型肺炎球菌中一定有某种特殊的生物分子或遗传物质 可以使无害的R型肺炎球菌转化为有害的S型肺炎球菌这种生物分子或遗传物质是什么呢 著名的肺炎球菌实验 纽约洛克非勒研究所Avery从加热杀死的S型肺炎球菌将蛋白质 核酸 多糖 脂类分离出来 分别加入到无害的R型肺炎球菌中 结果发现 惟独只有核酸可以使无害的R型肺炎球菌转化为有害的S型肺炎球菌 1944年结论 DNA是生命的遗传物质 噬菌体侵染实验 分布 DNA 主要在细胞核中 是染色体的主要成分 此外在线粒体 叶绿体 RNA 主要在细胞质中 此外在线粒体 细胞核 核仁 二 核酸的组成成分 核酸是一种线形多聚核苷酸 polynucleotide 其基本结构单位是核苷酸 nucleotide 核苷酸的基本结构 一 核酸中的戊糖 D 核糖 D ribose D 脱氧核糖 D deoxyribose 核酸据此分类 脱氧核糖 DNA 核糖 RNA 核酸中的戊糖均为 D 型 核苷酸 从两类核酸的水解产物可看到它们组成的差别 二 碱基 核酸中的碱基分两类 1 嘧啶碱 pyrimidine 是嘧啶的衍生物 嘧啶 1 2 3 4 5 6 H 胞嘧啶Cytosine C 尿嘧啶uracil U H H 胸腺嘧啶thymine T 2 嘌呤碱 purine 由嘌呤衍生而来 1 2 3 4 5 6 7 8 9 嘌呤 腺嘌呤adenine A 鸟嘌呤guanine G 3 稀有碱基 一些修饰碱基 因含量甚少而称之 大多为甲基化碱基 多在tRNA中 三 核苷 nucleoside 核苷 戊糖与碱基缩合而成 并以糖苷键相连接 糖苷键 二者的连接是C N键 称N 糖苷键 腺苷 尿苷 OH 假尿苷 核苷的表示 核苷 A G C U脱氧核苷 dA dG dC dT修饰核苷 如5 甲基脱氧胞嘧啶 m5dC 脱氧核糖核酸和核糖核酸异同的对比 四 核苷酸 nucleotide nt 1 种类 1 按酯化位点 可在核糖的2 3 5 2 按核糖类型 核苷酸 脱氧核苷酸 核苷中戊糖的羟基被磷酸酯化 即为核苷酸 2 结构 3 表示 与一个磷酸结合 MP d AMP d GMP d CMP d TMP UMP与二个磷酸结合 DP 如 ADP与三个磷酸结合 TP 如 ATP 核苷酸 4 特殊核苷酸 环核苷酸 核糖3 5 成环 cAMP cGMP功能 第二信使 激素 一些药物 神经递质通过其发挥生理作用 核苷酸 核苷酸衍生物 环化磷酸化 cAMP cGMP 核苷酸衍生物 5 IMP5 肌苷酸 5 次黄嘌呤核苷酸 5 GMP 五 核苷酸的连接方式 1 3 5 磷酸二酯键将核苷酸连接成核酸大分子 一 核苷酸 2 核酸的一级结构 多核苷酸链中各核苷酸残基的排列顺序 3 5 1 P P P OH A T G pGpTpAOH pG T A pGTA 1 一级结构表示方法如上 2 读向 碱基序列从左到右表示5 3 由3 5 磷酸二酯键连接 若两链反向平行 则需注明每条链的走向 如 5 A T G C C T G A3 3 T A C G G A C T5 核苷酸 三 DNA 一 DNA的一级结构 由数量庞大的4种脱氧核苷酸通过3 5 磷酸二酯键连接成的直线形或环形多聚体 二 DNA的双螺旋二级结构 1 双螺旋结构模型建立的依据 1 chargaff对DNA碱基组成的定量分析 提出碱基配对原则 A T G C2 根据对DNA纤维和晶体的x 衍射分析 3 电位滴定证明 A T G C DNA 双螺旋中的碱基对 basepair bp 2 双螺旋结构的特点 Watson Crick模型 1 形成 两条链反向平行 DNA一条链为另一条链互补链右手螺旋 DNA 2 结构 A 核糖 磷酸以3 5 磷酸二酯键连接成骨架 碱基在内 A T G CB 大沟 小沟 DNA 3 尺寸 DNA A 直径 2nm B 碱基距离 0 34nm C 一周10个核苷酸 D 螺距 3 4nm 4 双螺旋的稳定性 A 依靠碱基堆积力B 氢键C 离子键 3 二级结构的构象类型 DNA B DNA A DNA Z DNA B DNA与A DNA 几种DNA钠盐的特点 B DNA 生理状态下多为此种 92 相对湿度A DNA 右手螺旋 75 相对湿度 生理状态下多见dsRNA DNA RNAZ DNA 人工合成 左手螺旋 嘧啶 嘌呤交替 有m5dC 与基因表达调控有关 此外 还发现有C D E等型 三 DNA的三级结构 DNA双螺旋进一步扭曲即成三级结构 天然DNA有双链DNA dsDNA 有的病毒为单链DNA ssDNA 在dsDNA中 线形分子 大多数 环状分子 dcDNA 质粒 DNA 1 超螺旋结构 特点 可将长链压缩在一较小体内 密度大 凝胶电泳中移动速度快 DNA 回文结构中的单链可形成发夹结构 特殊DNA的结构 上页下页章首节首 双链回文结构可形成十字架结构 特殊DNA的结构 上页下页章首节首 DNA的其他结构 DNA三股螺旋概念是在1957年提出来的 当时有人发现 人工合成的一条右手螺旋多聚物 A n与另两条右手螺旋多聚物 T n形成三股螺旋结构 这是分子间的三股螺旋 此后有人研究证明 聚dA链首先与一条聚dT链互补形成双螺旋 然后 在高盐条件下 另一条dT链再同双螺旋形成三股螺旋结构 双螺旋结构通过Watson Crick氢键稳定而三股螺旋是通过Hoogsteen氢键稳定 DNA的三股螺旋结构 2 核小体中的扭曲方式 在真核细胞染色质中 DNA双螺旋分子盘绕在组蛋白上形成核小体 许多核小体由DNA连成念珠状结构 再盘绕压缩成高层次的结构 染色体 DNA 真核生物 DNA和蛋白质组装成染色体 染色体的基本单位是核小体 核小体进一步旋转折叠形成棒状染色体 将近1m长的DNA分子容纳于直径只有数微米的细胞核中 1 DNA是遗传信息的载体 半保留复制保证了亲代性状传到子代 保证了亲代与子代的相似性 DNA 四 DNA的功能 2 DNA是变异的物质基础 变异是生物进化的基础 变异的发生 1 DNA复制时出错 2 理化因素等引起碱基变化或缺失 使DNA碱基序列改变 从而发生性状变异 DNA 四 RNA 一 RNA的结构组成 4种核苷酸 有稀有碱基 连接 同DNA形成 一般以DNA为模板合成 有例外 结构 单链线形分子 局部区域有双螺旋 二 RNA的类型 三种 信使RNA messengerRNA mRNA 核糖体RNA ribosomelRNA rRNA 转运RNA transferRNA tRNA RNA 三种RNA的功能 mRNA是遗传信息的携带者 在细胞核中转录DNA上的遗传信息 再进入细胞质 蛋白质合成的模板 tRNA起识别密码子和携带相应氨基酸的作用 rRNA和蛋白质共同组成的复合体就是核糖体 核糖体是蛋白质合成的场所 1 tRNA 约占全部RNA的15 由70 90个核苷酸组成许多种类 沉降系数4S RNA 1 tRNA结构 一级结构多已清楚 含较多稀有碱基 二级结构为三叶草有 aa臂 二氢嘧啶环 反密码环 可变环 T 环 RNA 主要特征 1 四臂四环 2 氨基酸臂3 端有CCAOH的共有结构 3 D环上有二氢尿嘧啶 D 4 反密码环上的反密码子与mRNA相互作用 5 可变环上的核苷酸数目可以变动 6 T C环含有T和 7 含有修饰碱基和不变核苷酸 tRNA三级结构为倒L型 A 在pr合成中转运aa B 在pr合成的起始 DNA反转录合成及其它代谢调节中起作用 2 tRNA功能 2 mRNA和hnRNA 1 合成 以DNA为模板 核内 合成hnRNA 含内含子和外显子 加工成熟的mRNA入细胞质蛋白质合成 RNA 合成mRNA 切除内含子 2 mRNA结构特点 3 末端有polyA结构 与mRNA从核入质有关 5 末端有帽子结构 G被甲基化 此可能与pro合成的起始有关 3 功能 是蛋白质合成的模板 3 rRNA 1 占RNA总量的80 是构成核糖体的骨架 2 核糖体功能 pr合成的部位 3 结构 分大 小亚基一 二级结构多已确定 但功能不清 RNA 原核细胞 70S核糖体 真核细胞 80S核糖体 核糖体RNA自我剪切 1983年在四膜虫中发现RNA有催化功能 4 RNA的功能 1 在DNA复制 转录 翻译中起重要调控作用 2 有催化作用 3 可作为遗传物质 如逆转录病毒 RNA 五 核酸的性质 一 一般的理化性质 为两性电解质 通常表现为酸性 DNA为白色纤维状固体 RNA为白色粉末 微溶于水 不溶于一般的有机溶剂 DNA溶液的粘度极高 而RNA溶液要小得多 核酸在离心力的作用下 可以从溶液中沉降下来 其沉降速度与核酸的大小和密度有关 核酸的溶解性质 DNA和RNA都微溶于水 不溶于乙醇 氯仿等有机溶剂 DNP溶于高浓度盐溶液中 而RNP溶于低浓度盐溶液 利用这一性质可分离DNA和RNA 0 14摩尔法 分离DNA蛋白 DNP 和RNA RNP 蛋白 RNP 的方法DNA蛋白 在0 14mol L的NaCl溶液中溶解度最低 RNA蛋白 在0 14mol L的NaCl溶液中溶解度较大 水解性 可被酸 碱或酶水解 DNA比RNA对稀碱稳定 核酸分子中的磷酸二酯键可在酸 碱性和酶条件下水解切断 结果是多核苷酸链被打断 核酸被降解 酸解酸可以使DNA和RNA降解 酸对核酸的作用因酸的浓度 温度和作用时间的不同而不同 碱解 DNA和RNA对碱的耐受程度有很大差别 例如 在0 1mol LNaOH溶液中 RNA几乎可以完全水解 生成2 或3 磷酸核苷 DNA在同样条件下则不受影响 这种水解性能上的差别 与RNA核糖基上2 OH的参与作用有很大的关系 在RNA水解时 2 OH首先进攻磷酸基 在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯 再在碱的作用形成水解产物 DNA在稀碱的作用下 只会发生变性 不会发生磷酸二酯键的水解 酶水解 1 根据底物分类DNase RNase 单链核酸酶 双链核酸酶 杂合双链核酸酶2 根据催化部位分类 外切核酸酶和内切核酸酶外切酶 5 端 3 端或3 端 5 端核酸外切酶 内切酶 限制性核酸内切酶和非限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶 restrictionendonucleases 能够识别DNA分子的特定核苷酸序列 并在识别位点或其周围断开DNA双链的一类核酸酶 DNA限制性内切酶 细菌的限制 修饰系统 限制性核酸内切酶 限制酶 特异性强 可在DNA特异位点切开 细菌碱基修饰 概念 在DNA特定短碱基序列上产生某专一性修饰 使得内切酶无法识别而不能断裂 如 修饰甲基化酶 参与DNA修复及RNA合成后的剪接等重要基因复制和基因表达过程负责清除多余的 结构和功能异常的核酸 同时也可以清除侵入细胞的外源性核酸在消化液中降解食物中的核酸以利吸收体外重组DNA技术中的重要工具酶 生物体内的核酸酶负责细胞内外催化核酸的降解 颜色反应 1 核糖与浓盐酸和苔黑酚 甲基间苯二酚 共热呈绿色 在670nm处可测RNA 2 2 脱氧核糖与酸和二苯胺共热呈蓝紫色 在595nm处可测DNA 二种反应可作定性试验 定量试验灵敏度低 准确性差 但快 简便 核酸的性质 1 一个单链DNA和一个单链RNA分子量相同 试述可以用几种方法将它们区分开 2 转食品基因安全吗 转基因有两派反对派 反对派的道理在于转基因抗病抗虫的功能来自于毒蛋白基因 虫吃了是要死的 人吃了怎么办 赞成派 昆虫的死亡是因为气孔闭塞了 但这跟人的消化道完全是两码事 中间派 人民不是小白鼠 二 紫外吸收性质 碱基具共轭双键强烈吸收260 290nm波段紫外光 最大吸收峰在260nm附近 应用 1 不同核苷酸有不同吸收特性 可用紫外分光光度计进行定性 定量测定 1OD相当于 50 g mlDNA40 g mlRNA 核酸的性质 2 确定所提取的核酸是否纯品 1 DNA OD260 OD280 1 8纯品2 RNA OD260 OD280 2 0纯品在纯化DNA时 通常用A260 A280 1 8 2 0作为纯度标准 若大于此值 表示有RNA污染 若小于此值 则有pro或酚污染 核酸的性质 三 核酸结构的稳定性 1 碱基堆积力 双螺旋内部碱基形成的疏水区 2 碱基间的氢键 3 磷酸基与介质中阳离子形成的离子键 核酸的性质 四 核酸的变性 1 变性的概念1 现象 双螺旋DNA和具双螺旋区的RNA氢键断裂 空间结构被破坏 形成单链无规则线团状的过程 核酸的性质 2 结果 A 增色效应 260nm紫外吸收增加 B 粘度下降 C 生物学性能部分或全部丧失 3 引起变性的因素 温度 pH 尿素 甲醛等 核酸的性质 增色效应 DNA变性后 由于双螺旋解体 藏于螺旋内部的碱基暴露出来 使DNA的A260值升高 这种现象称为增色效应 变性DNA 天然DNA 2 热变性与Tm Tm 在热变性中 紫外吸收增加量达最大增量一半的温度 称该DNA的熔解温度 meltingtemperature Tm 又称热解链温度 G C Tm 69 3 2 44 核酸的性质 3 影响Tm的因素 1 G C含量 Tm与G C含量成正比 2 介质中的离子强度 离子强度低 Tm低 在纯水中 DNA在室温下即可变性 3 溶液的pH 4 变性剂 核酸的性质 五 核酸的复性 概念 变性DNA在适当条件下 缓慢降温 可使两条彼此分开的链重新缔合成双螺旋结构的过程 复性后 许多物化性质可得到恢复 生物学活性部分恢复 影响因素 温度 DNA片段大小 DNA浓度 碱基重复序列多少 离子浓度 核酸的性质 DNA变性与复性 减色效应 当变性的DNA经复性又重新形成双螺旋结构时 其溶液的A260值减小 最多可减小至变性前的A260值 这种现象称为减色效应 六 分子生物学技术 一 分子杂交与探针技术1 概念 1 分子杂交 hybrization 在退火条件下 不同来源的DNA互补区形成氢键 或DNA单链和RNA链的互补区形成DNA RNA杂合双链的过程 DNA DNA DNA RNA 分子生物学技术 核酸的杂交 2 探针 probe 用放射性同位素或荧光标记的DNA或RNA片段 确诊病人细胞中提取的DNA 病毒DNA 肿瘤组织提取的DNA 分子生物学技术 3 Southern印迹法 分子生物学技术 用于检测DNA方法 如图 Northern印迹法 用于检测RNANorthern印迹法 将电泳分离后的RNA吸印到纤维素膜上再进行分子杂交 4 聚合酶链式反应 polymeerasechainreaction PCR 聚合酶链式反应 PCR 每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍 30轮循环可获得 230 1 07 109 个基因片段 应用 广泛用于克隆 测序 产生特异突变 医学诊断和法医 核酸分子的核苷酸序列分析是以纯品核酸为材料 经水解 测定核苷酸组成及比例 先以外切酶确定5 或3 末端核苷酸 再以内切酶将核酸链分为若干寡核苷酸段 分段测定核苷酸组成 比例和序列 最后将核苷酸序列的各寡核苷酸重叠 确定整个核酸分子的核苷酸序列 五 核酸序列分析 核苷酸序列分析中断裂磷酸二酯键用酶 DNA酶法测序 1977年sanger发明末端终止法测定DNA序列 根据sanger测序法 现在已经有各种DNA自动测序仪 DNA测序速度大大加快HGP得以提前完成 DNA酶法测序 DNA酶法测序 平行进行四组反应 每组反应均使用相同的模板 相同的引物以及四种脱氧核苷酸 并在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸 使其随机地接入DNA链中 使链合成终止 产生相应的四组具有特定长度的 不同长短的DNA链 这四组DNA链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开 经过放射自显影显示区带 就可以直接读出被测DNA的核苷酸序列 如下图所示 DNA酶法测序 DNA酶法测序 本章总结 核苷 核苷酸 cAMP 磷酸二脂键 脱氧核糖核酸 DNA 核糖核酸 RNA 核糖体核糖核酸 rRNA 信使核糖核酸 mRNA 转移核糖核酸 tRNA 碱基对 查盖夫定律 Chargaff srules 大沟和小沟 DNA超螺旋 DNA变性 退火 熔解温度 Tm 增色效应 减色效应 核酸的化学结构 碱基 核苷 核苷酸 DNA的结构 DNA的一级结构 二级结构 RNA的结构 RNA的类型和结构特点 tRNA mRNA rRNA的结构和功能 核酸的性质 解离性质 水解性质 光吸收性质 沉降特性 变性 复