分子诊断技术的应用进展ppt课件.ppt

1 分子诊断临床应用进展 主要内容 分子诊断概念的演变分子诊断技术的分类基于杂交基础的分子诊断技术及其应用基于扩增基础的分子诊断技术及其应用基于测序基础的分子诊断技术及其应用分子诊断应用前景展望 3 多聚酶链式反应 PCR PolymeraseChainReaction Polymerase DNA聚合酶 4 链式反应 改变世界 核裂变链式反应 分子诊断概念的变化 分子诊断 应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化而做出诊断的技术 称为分子诊断 分子诊断是预测诊断的主要方法 既可以进行个体遗传病的诊断 也可以进行产前诊断 分子诊断的材料包括DNA RNA和蛋白质 基因诊断 又称DNA诊断或分子诊断 通过分子生物学和分子遗传学的技术 直接检测出分子结构水平和表达水平是否异常 从而对疾病做出判断 分子生物学 从分子水平上研究生命现象物质基础的学科 研究细胞成分的物理 化学的性质和变化以及这些性质和变化与生命现象的关系 如遗传信息的传递 基因的结构 复制 转录 翻译 表达调控和表达产物的生理功能 以及细胞信号的转导等 分子诊断技术的分类 根据目的基因是否被放大分类可分为杂交法和扩增法根据被测基因的核酸类型分类Southern印迹用于检测DNA Northern印迹用于检测RNA 斑点印迹或称斑点杂交 既可检测DNA也可检测RNA 根据诊断目的或要求分为定性诊断 定量诊断和半定量诊断 以及序列分析等根据分子之间的作用形式杂交 扩增 测序 基于分子杂交为基础的分子诊断技术发展及其应用基于分子杂交为基础的分子诊断技术发展及其应用基于分子杂交的分子诊断技术及其应用 两条同源核酸分子 DNA或RNA 可以在碱基互补的原则下形成异质双链是遗传物质最重要的化学特征 这一过程亦被称为分子杂交 molecularhybridization 分子杂交是所有分子生物学技术的基础 从最初的印迹杂交 southernBlot和northernBlot 到实时PCR realtimePCR 从基因芯片再到高通量的DNA测序技术 都离不开碱基互补的分子杂交反应 而且在理论上可以特异性相互作用的两个不同分子 例如核酸与核酸之间 A G G C 蛋白与蛋白之间 抗原和抗体 甚至核酸和蛋白之间 适体与多肽 的相互作用都可以视为分子杂交的不同表现模式 因此 广义的分子杂交技术是指以核酸 蛋白 糖基以及细胞 代谢物等分子的相互作用所建立的分析方法 目前临床应用的以分子杂交技术为基础的诊断技术繁多 缺乏统一的分类方法 但是可以根据实验方法的差异分为主要的两种类型 一类是通过特异性的标记探针检测检测细胞内的核酸物质 而另一类是通过探针检测从细胞内提取的核酸 蛋白等物质 前者以原位杂交及其衍生的技术为主 后者以生物芯片及其衍生的技术为主 荧光原位杂交 FISH 原位杂交应用特异性的探针检测细胞内的核酸需要标记分子显示杂交信号 1960s年代的检测技术是放射性核素标记 但是信号检测程序复杂并且可能存在放射性物质的污染 而荧光物质标记可以通过显微镜直接观察实验结果 因此荧光标记的原位杂交技术 Fluorescentinsituhybridiztion FISH 一经出现立刻取代了放射性标记的技术 成为应用最广泛的分子杂交技术 FISH技术通过荧光标记探针 可以可视化的检测人类细胞或组织中特定基因的数量及其定位 是分子杂交与细胞遗传学技术的结合 IFSH技术的分析过程分为四个步骤 核酸变性 探针变性 杂交及信号检测 因此 针对探针标记 染料开发和图像分析的技术的更新是FISH分析技术发展的主要路径 荧光原位杂交衍生技术 首先是荧光染料的应用 从最初的单色FITC应用 发展到使用多种荧光染料的多色FISH技术 既多元荧光原位杂交和光谱核型分析技术 使用五种染料 Rhodamine Texas red Cy5 FITC andCy5 5 标记的探针可以在一次试验中定位多种不同的基因以及使用不同的颜色标记显示24条不同的染色体 其次 在探针方面 染色体臂 着丝粒 端粒特异的探针被先后开发应用 而且应用微切割技术切割技术制备亚区域探针 microFISH 使FISH的基因定位和分辩率大大提高 6 同时 探针标记对象和标记技术的发展不断衍生出新的FISH技术 例如比较基因组杂交 引物原位标记技术 肽核酸探针原位杂交 物种交叉荧光原位杂交 纤维原位杂交等 在图像与信号分析方面 应用高分辨率CCD摄像机和计算机自动图像分析系统获得广泛应用 而SKY结合傅立叶频谱技术 同时计量可见光和近红外范围内的所有点的发射频谱而一次成像 荧光原位杂交结果 JournalofCellScience2003 116 14 FISH的应用 在产前诊断方面 FISH主要用于染色体数目异常的诊断 与常规核型分析的一致性可以达到99 5 但结果报告时间只要24小时 大大低于核型分析的平均2周左右的报告时间 FISH在多数的发达国家已经批准为常规产前筛查辅助诊断技术 在血液肿瘤的诊断方面 FISH用于染色体异位的融合基因检测 基因缺失检测 微小残留病灶监测 骨髓移植监测等 在感染性疾病检测方面 FISH检测痰液标本中铜绿假单饱菌 流感嗜血杆菌等常见菌的敏感性可以达到90 特异性100 9 对于军团菌 幽门螺旋杆菌和结核杆菌等较难培养鉴定的细菌 FISH在快速诊断上也显示了很好的应用前景 在实体肿瘤的应用中 FISH可以检测任何组织类型的染色质和基因的异常 广泛应用于肺癌 乳腺癌 膀胱癌 宫颈癌等实体肿瘤的肿瘤的辅助诊断 疗效检测 个体化治疗和预后判断 FISH用于药物靶向性基因表达状态的检测 在乳腺癌治疗药物曲妥珠单抗 赫赛汀 治疗有效性患者筛选中 FISH被认为是检测HER2基因表达状态的金标准 生物芯片技术 生物芯片 Biochip 是通过微加工技术和微电子技术将大量特定序列的寡合苷酸片段 抗原 抗体 甚至细胞或组织等生物大分子 按照矩阵方式高密度的固定或直接合成在玻璃 硅片 聚丙烯 磁性微球等固项支持物上 或者整合微流体技术以及微电级 为传感器等制备的类似于电子行业的芯片样产品的检测技术 固化的探针分子与荧光标记的相应样本进行杂交 通过荧光检测系统扫描分析及计算机软件分析 达到高通量分析生物信息的目的 生物芯片技术可以根据功能的不同分为微阵列芯片 Microarraychip 微流控芯片 Microfluidics 和芯片实验室 LAB on chip LOC 生物芯片技术 微阵列芯片 早期的微阵列芯片 Microarray 单指基因芯片 genechip DNAchip 但随着蛋白芯片 proteinchip 以及糖类芯片 glycanchip 的出现 Microarray逐渐被称为微阵列芯片 强调将大量探针有序固化在固相支持物上的检测方法 而根据探针种类的不同可以分为基因芯片 蛋白芯片及糖类芯片 生物芯片技术可以根据功能的不同分为微阵列芯片 Microarraychip 微流控芯片 Microfluidics 和芯片实验室 LAB on chip LOC 微流控芯片 是在几平方厘米的单晶硅片 石英 玻璃或有机聚合物等材料上刻制微通道 实现样本预处理 反应 分离和检测的微型检测平台 可快速高效 高通量的完成基因 蛋白及各种小分子分析和鉴定芯片实验室 是在微流控芯片基础上发展了更为复杂的分析系统 将微机电技术于微流体技术相结合 将所需的反应均集中在一块芯片上 建立微型分析系统 Micrototalanalyticalsystem u TAS 微阵列芯片分析流程 蛋白芯片技术 糖组芯片技术 微流控芯片技术 AFP L3流控芯片 芯片技术的应用 目前生物芯片可以应用的范围包括 病原体的快速检测 亚型分析及耐药性检测 肿瘤的分类 分期与筛查 遗传性疾病的诊断于筛查 自身免疫性疾病的诊断等等 国外的生物芯片开发较早 许多成熟的生物芯片的检测平台已逐渐应用于临床 例如美国Osmetch公司的e SensorCFtest 检测Cysticfibrosis 和Roche Affymetrix的CYP450芯片 检测药物代谢相关基因CYP2D6和CYP2C19 Agendia公司的Mammaprint芯片 检测乳腺癌相关基因 这三种芯片均已获得美国FDA的批准应用于临床实验室 sFDA注册主要分子诊断产品 国内企业 基于扩增基础的分子诊断技术及其应用 1983年Mullis发明了聚合酶链式反应 Polymerasechainreaction PCR 使体外扩增DNA成为可能 开启了体外扩增和操作DNA或RAN技术的发展 在之后的20多年里 扩增DNA的技术成为分子诊断应用最广的技术之一 发展变化了数十种核酸扩增检测技术 目前缺乏统一的核酸扩增技术的分类 但根据DNA被扩增的过程中是变温还是恒温方式 可以将核酸扩增技术分为两类 温度循环式的扩增技术 以常规 conventionalPCR 和实时PCR realtimePCR RT PCR 为主 等温方式的扩增技术 以核酸序列扩增法 nucleicacidsequence basedamplification NASBA 转录介导的扩增 Transcription mediatedamplification TMA 环介导等温扩增 Loop mediatedisothermalamplification LAMP 等技术为主 温度循环式的扩增技术 常规PCR 在扩增反应结束后对产物进行电泳或杂交等方式的分析 因此与其他技术的结合衍生出多种分析方法 例如PCR结合限制性长度多态性分析 PCR RFLP PCR结合特异性寡合苷酸探针斑点杂交 PCR ASO PCR结合变性梯度凝胶 PCR DGGE PCR结合的单链构象多态性 PCR SSCP 等分析技术 RT PCR 病原体的多重PCR MultiplexPCR 提高敏感性和特异性的巢式PCR nestedPCR 研究基因表达的原位PCR insituPCR 分析RNA的逆转录PCR RT PCR 以及锚定PCR 不对称PCR 膜结合PCR等等 不同方式的PCR技术 加热变性 冷却粘合 扩增 连接酶融合 冷却 聚合酶 dNTP 连接酶 点突变的研究 微生物病原体的检测及定向诱变 单碱基遗传病多态性及单碱基遗传病的产物诊断 微生物种型鉴定 癌基因的点突变研究 连接酶链反应 等温方式的扩增技术 恒温扩增技术主要包括 核酸序列扩增法 nucleicacidsequence basedamplification NASBA 转录介导的扩增 Transcription mediatedamplification TMA 环介导等温扩增 Loop mediatedisothermalamplification LAMP 链置换扩增法 stranddisplacementamplification SDA 滚环扩增法 RollingCrileAmplification RCA 复制酶扩增QB等 等温方式的扩增技术 NASAB 通过AMV逆转录酶 T7RNA聚合酶 RnaseH三种酶的协同作用为核酸扩增提供动力 逆转录酶将RNA转录成cDNA 生成的RNA DNA 产物被RnaseH分解为单链DNA 引物2结合DNA 再在逆转录酶作用下合成双链DNA 双链DNA上引物携带的T7RNA聚合酶的启动子序列将DNA转录成RNA RNA又可以生成DNA 使反应循环发生 TMA 使用逆转录酶和T7RNA聚合酶 在反应中同时利用逆转录酶酶的逆转录活性和Rnase活性 反应动力的维系与NASBA类似 LAMP 技术是利用BstDNA聚合酶的链置换活性提供反应动力 SDA 是应用DNA聚合酶的5 3 核酸外切酶活性从双链DNA上的缺口处开始合成新链 剥离旧链 当缺口重复产生时 切割 延伸 链置换的过程循环进行 目的片段被扩增 RCA 利用环状DNA与强链置换活性的 29DNA聚合酶为DNA延伸提供动力 NSAB 操作简便不需特殊仪器不需温度循环循环次数少忠实性高特异性好扩增效率高于标准PCR TMA 以扩增为基础的方法的临床应用 DNA或RNA的扩增技术 最直接的优势是在较短的时间内将目的基因的拷贝数大量扩增 具有很高的灵敏度 同时特异性的引物保证了较高的特异性 因此 在分子诊断技术中基于扩增的技术 特别是荧光定量PCR技术 在实验诊断中应用最为广泛 PCR技术可以准确的定量感染性疾病病原体 不论是真菌 细菌和病毒以及寄生虫的感染都可以应用扩增技术加以检测 同时同一种病原体可以买到多种扩增原理的商业化检测试剂 目前在sFDA注册的应用PCR方法的体外诊断试剂已达到190余种 成为病原体和基因表达与突变检测的最主要的试剂 为提高PCR的检测通量 新进发展的多重PCR技术以及多重连接探针扩增技术 Multiplexligation dependentProbeamplification MLPA 可以一次在同一样本中同时检测多种病原体 最大可同时扩增45个目的片段 同时 对PCR产物的高分辨率溶解曲线分析 为基因分型和突变扫描提供了新的手段 可以预见PCR技术仍将主导临床实验室感染性病原体的检测 细菌的耐药基因检测 肿瘤个体化治疗的主要检测工具 基于测序基础的分子诊断技术及其应用 人类基因组计划的出现 使人们面临了巨大的经费问题 因为传统的Sanger测序法无论如何优化 也无法大幅度降低测序费用 人类以及其它主要模式生物参考序列数据库的建立使得短片段作图成为可能 这极大地促进了短片段测序技术的发展 不断涌现的新型分子生物学技术极大地促进了分子生物学的发展 随之而来的越来越多的比如基因变异 RNA表达 蛋白与DNA相互作用以及染色体构象等等生物学现象需要人们用高通量DNA测序手段去解释 这也极大地促进了新型测序技术的发展 其它学科 各项相关技术的发展 例如显微镜技术 表面化学技术 核苷生化技术 聚合酶工程技术 计算机技术 数据储存及分析技术等 为DNA测序技术提供了极大的支持 测序技术发展的动力 新一代测序仪 美国RocheAppliedScience公司的454基因组测序仪美国Illumina公司和英国Solexatechnology公司合作开发的Illumina测序仪美国AppliedBiosystems公司的SOLiD测序仪Dover Harvard公司的Polonator测序仪美国Helicos公司的HeliScope单分子测序仪 新一代测序原理 新的测序策略 循环芯片测序法 cyclic arraysequencing 循环芯片测序法 简言之就是对布满DNA样品的芯片重复进行基于DNA的聚合酶反应 模板变性 引物退火杂交及延伸 以及荧光序列读取反应与传统测序法相比 循环芯片测序法具有操作更简易 费用更低廉的优势 新一代测序仪的特点 体外构建DNA文库 随后体外克隆扩增待测DNA片段 这就解决了传统Sanger测序技术中好几个限制平行测序规模的瓶颈问题 比如转化大肠杆菌以及阳性克