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微波辅助提取-高效液相色谱法测定疏果中Vc含量2014年5月11日微波辅助提取-高效液相色谱法测定蔬果中Vc含量摘要 本实验先采用微波辅助萃取法快速萃取柠檬中的Vc，以1mol/L乙酸为萃取剂，再采用高效液相色谱进行定性定量分析，以3%的乙腈-0.05mol/L KH2PO4水溶液作为流动相。通过对比停留时间进行定性分析，通过计算峰面积以及制作校准曲线进行定量分析。校准曲线在Vc浓度在5-100mg/L范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系，相关系数为0.9991。结果测得柠檬中Vc的含量为42.52mg/100g。本实验方法具有用样少、分析快、操作简单、准确度高等特点。关键词 微波提取 高效液相色谱 维生素C 柠檬1 引言 维生素C（Vitamin C, Vc）又叫抗坏血酸，是一种水溶性维生素。Vc在体内参与多种反应，如氧化还原过程，在生物氧化和还原作用以及细胞呼吸中起重要作用。人体内缺乏Vc时容易导致坏血病。同时，由于Vc是一种水溶性的强有力抗氧化剂并参与胶原蛋白的合成，它同时还具有防癌、预防动脉硬化、治疗贫血、抗氧化和提高人体免疫力等功效。Vc在蔬果中普遍存在，尤其是柑桔类水果中含量较高。樱桃、番石榴、辣椒、猕猴桃等水果中Vc含量在50-300 mg/100 g。 微波辅助提取利用与极性物质的热效应及非热效应来提高提取效率，且以水或醇为溶剂，对环境无污染。1测定 Vc常用的方法有靛酚滴定法，分光光度法及高效液相色谱法等。靛酚滴定法测定的是还原型抗坏血酸，反应终点为粉红色，但如果果蔬的汁液为红色则会产生干扰，滴定终点不易判断。2而分光光度法操作费时3，高效液相色谱法是目前发展较快的一种检测方法，其具有高效、快速、稳定、可靠等特点。微波辅助萃取具有快速高效、操作简便、节省溶剂等优点，在天然产物、环境、食品等领域中得到广泛应用。本实验采用微波辅助萃取法快速萃取蔬果中的Vc，采用高效液相色谱进行分析，以Vc标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度做校准曲线，根据样品中Vc的峰面积，由校准曲线计算其浓度。本实验方法具有用样少、分析快、操作简单、准确度高等特点。2 实验部分2.1 仪器试剂2.1.1 仪器高效液相色谱仪：LC-20AT；微波萃取仪（上海新仪微波化学科技有限公司）；色谱柱：依利特或PhenomenexC18柱(250mm4.6mm，I.D.5m)。2.1.2 试剂乙腈（色谱纯），冰乙酸，维生素C，磷酸二氢钾等均为分析纯；小西红柿、桔子或西红柿样品。实验用水为超纯水。Vc标准溶液：快速准确称取0.025g Vc，用1mol/L乙酸溶液溶解，定量转移至250mL容量瓶中，用1mol/L乙酸溶液定容，得到100mg/L标准溶液备用，现用现配。2.1.3 色谱条件流动相：3%的乙腈-0.05mol/LKH2PO4水溶液（v/v）；流速1mL/min；柱温为室温，紫外检测波长265nm；进样量10L。2.2 实验步骤2.2.1 按操作说明开启液相色谱仪，设定方法参数。2.2.2 校准曲线绘制：分别配制 5，20，50，80，100 mg/L 的 Vc 样品溶液，待液相色谱稳定后进样分析。以Vc 色谱峰面积对浓度作图，绘制校准曲线。2.2.3 样品准备：准确称取柠檬果肉5.0130g，以1 mol/L乙酸50 mL 为萃取溶剂，微波功率设为600W，萃取时间为5min，萃取温度设定为50，平行萃取两次。萃取液过滤后用1 mol/L乙酸溶液定容至100mL，制成供试品溶液。2.2.4 定性分析：分别取10L 50 mg/L的Vc 标准溶液和供试品溶液，进HPLC 分析。根据保留时间定性分析蔬果中的Vc。2.2.5 定量分析：供试品溶液经 0.45 m微孔滤膜过滤后进行 HPLC 分析。平行测定2次，记录其Vc 的色谱峰面积，根据校准曲线计算蔬果样品中Vc 的含量，结果以 mg/100g表示。3. 实验结果与讨论3.1 实验结果3.1.1 校准曲线的绘制表1 标准溶液的浓度及对应的峰面积浓度c/mgL留时间t/min2.7542.7532.7722.7722.778峰面积A118931548268155133924711593209195根据峰面积对浓度描点，曲线拟合后得到以下校准曲线。峰面积 图1Vc峰面积-浓度校准曲线所得校准曲线方程为：峰面积A=32420c/mgL-1-73652，相关系数R2=0.9991。3.1.2 样品色谱图3.1.2 数据处理根据峰面积A=32420c/mgL-1-73652，代入样品中Vc色谱峰的峰面积，求出检测液浓度；转换成各种水果中Vc的含量如下表所示：表2 各种样品的色谱数据样品样品质量m/g保留时间t/min峰面积Vc浓度c/mgL-1*1Vc含量mg/100gMeat15.00372.92658663720.3740.71Meat25.01302.97161757421.3242.52Skin15.10492.764230842.984*2Skin25.11702.656487423.775*1含量=c100L1000100gm*2因其Vc浓度过低，小于5mg/L，超出线性范围，故得不出精确的Vc含量。3.2 讨论与总结 本实验采用微波提取-高效液相色谱法测定柠檬中果肉的Vc含量，测得果肉1 Vc含量为40.71mg/100g，果肉2Vc含量为42.52mg/100g，而果皮中Vc含量低，已超出线性范围。而校准曲线的公式为峰面积A=32420c/mgL-1-73652，相关系数R2=0.9991，结果较为准确。对于误差分析，一方面，Vc标准溶液的用1mol/L乙酸配制，Vc在酸性环境 (pH3.44.5)溶液中比在碱性溶液中较为稳定4，但仍有部分被氧化的可能，这会造成标准溶液实际所含的Vc量低于标识值，从而导致测定值偏高。另一方面，在样品预处理过程中，部分Vc会被空气中的氧气氧化破坏，从而导致测定值偏低。微波辅助提取-高效液相色谱法测定蔬果中的Vc含量，具有用量少、灵敏度高、操作简单、分析速度快、准确度高等特点，是一种合理有效的检测方法。5思考题（1）校准曲线法有何优缺点？液相色谱法中常用的定性定量方法有哪些？答：校准曲线法法优点是操作、计算简单，通常可以建立稳定、良好的线性关系，测定比较准确，适用于大量样品的分析，但缺点是每次分析的色谱条件很难完全相同，标准工作曲线的绘制一般使用欲测组分的标准样品，而实际样品组成与其差别很大，因此容易出现较大误差。液相色谱法中常用的定性定量方法有标准曲线法，内标法和标准加入法，其中最常用的是标准曲线法。（2）如何快速建立未知物的液相色谱方法？一般应考虑哪些主要因素？答：建立未知物的液相色谱法，应分别考虑色谱柱、洗脱剂和洗脱方式的选择，以及添加剂的选择。首先根据待测物质的性质确定检测模式，如，待测物为弱碱性，则应采用正离子作为检测模式，所以为了保证化合物既在色谱柱上保留，又能够充分地进行离子化，故可加入少量弱酸和有机物作为添加剂。 然后根据分析对象的极性性质选择合适的色谱柱，如正相色谱柱、反相色谱柱、离子交换色谱柱等，再确定洗脱剂和流速，根据需要的出峰时间，选择合适的洗脱方式，如等度和梯度洗脱。根据待分析物质的复杂程度，选择合适的定量方法，如归一化法、标准曲线法、内标法以及标准加入法等。（3）微波辅助萃取法为何能达到快速高效的萃取效果？答：微波辅助萃取法通过微波增加物质分子的能量，提高被提取的温度，从而加快分子的运动速率以增加溶解的速率；提高溶剂的温度，可增加被提取物在溶剂中的溶解度，达到高效的萃取效果。（4）试比较液相色谱法和气相色谱法优缺点。答：高效液相色谱法优点有：（1）高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。（2）高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在L数量级。（3）应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物的分离分析。（4）分析速度快，载液流速快。可反复使用，易回收。高效液相色谱的缺点是“柱外效应”。在进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著导致色谱峰的加宽、柱效率降低，高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。气相色谱法的优点是：（1）分离效率高，分析速度快。（2）样品用量少和检测灵敏度高，如气体样品用量为1mL，液体样品用量为0.1L，固体则为几微克。用适当的检测器能检测出含量在百万分之十几至十亿分之几的杂质。（3）选择性好，分离、可分析恒沸混合物，沸点相近的物质，某些同位素，顺式与反式异构体，邻、间、对位异构体，旋光异构体等。（4）应用范围广，虽然主要用于分析各种气体和易挥发的有机物质，但在一定的条件下，也可以分析高沸点物质和固体样品。缺点是：流动相和样品都必须处理成气体。它主要分析在操作温度下能汽化而不分解的物质，对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定物、离子型化合物及高聚物的分离不能分析，定性困难，致使其应用受到一定限制。参考文献1 刘小琴，范华均等. 微波辅助提取高效液相色谱法测定苦参中种苦参生物碱的含量.理化检验化学分册. 2012. 第28卷第3期. 299-3