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实验室层析柱装柱技术介绍 1 Columnpacking 好的柱效是层析成功的关键不同种类的凝胶 不同的层析柱有不同的装柱方法柱效测定的方法层析柱的维护 2 Columnpacking RabiesvaccineSepharose4FastFlow5 columnvolsample 3 Columnpacking 每米塔板数 N 1600 每米塔板数 N 3500 4 Columnpacking N m 5 54 Ve Vh 2100 L As b a 5 Columnpacking 检测装柱效果一般用 0 5 30um介质 或 1 90um介质 柱体积的1 丙酮测柱效和峰形Thelinearflowrateshouldbe30cm hfor34 mand50 mmediaand20cm hfor90 mmedia 6 线性流速对体积不同的柱子来说 体积流速不能直接用作比较 一般都换算成线性流速 再作比较 体积流速 ml min x60线性流速 cm hr 揪揪揪揪揪揪柱子横切面积 cm2 Columnpacking 7 Columnpacking Itisimportantthatthecolumnisproperlyequilibratedbeforethepackingisevaluated 2columnvolumes Itispreferabletorunthreetestrunstoseewhetherthetestvaluesarestable Ifapoorresultimprovesduringthistest thereasoncanbethatthecolumnwasnotproperlyequilibrated Tocheckthatthebedisstable runthecolumnat70 packingpressurefor20hoursandtestitagain preferablythreetestruns Notethatpressurespikesmaycausepoorpacking cracking Ifthishappens anairtrapandapressurereliefvalveareneededbetweenthepumpandthecolumn Thepressurereliefvalveshouldbeplacedbetweentheairtrapandcolumn 8 Columnpacking 9 装柱注意点 选择一根设计良好的柱子仔细混合均匀凝胶浆在生产时使用柱子的温度下装柱用平缓的动作将凝胶浆一次性加入柱子中用恒压或恒流装柱稳定和平衡凝胶柱床检查柱效 必要时重装 Columnpacking 10 用空柱子须留意 使用调节器 flowadaptor 保护柱床的同时更可提高分辨率 节省凝胶柱子物料须生物兼容 并有优良的化学抗性加上装柱器 packingreservoir 可一次把凝胶装满柱子 大大提高柱效 尤其是凝胶过滤柱 柱子的过滤网孔径应该是凝胶颗粒的1 3 一般10mm孔径就够用 如用SOURCE15介质装C柱和XK柱 须换上5mm的网 11 Columnpacking SepharoseFFbasedgel SepharoseQ DEAE SP Phenyl1 the75 slurryjustbeforepacking 2 Ideally FastFlowmediaarepackedataconstantpressurenotexceeding3bar 0 3MPa forXKcolumns 3 Ifthepackingequipmentdoesnotincludeapressuregauge useapackingflowrateofatleast400cm h 15cmbedheight 25 Ifrecommendedpressureorflowratecannotbeobrained usethemaximumflowthepumpcandeliver thisshouldalsogiveaeasonablywell packedgel Donotexceed75 ofthepackingflowrateinsubsequentchromatographicprocedures 12 Columnpacking Sepharose4FastFlow50 75 slurryjustbeforepacking 110cm hflowrateandthepressureshouldnotbeincreasedbeyond1 0bar3 5mmblowthesettledbedwasmade 13 Columnpacking SepharcylSHRFlowratesgivenbelow PackthegelinSTEP1for2hoursoruntilthegelhasreachedaconstantheight thenincreasetheflowratetothevaluelistedforSTEP2andpackfor60minutes Packingflowrates ml h ColumnSTEP1STEP2XK16 7060110XK16 10060100XK26 70150300XK26 100150270XK50 100500800 14 Columnpacking Superdex75 200pg50 slurry1step 20cm hflowrate 2hour2step stepthepressureisheldat3bar 1hour 15 Columnpacking SephadexG 2550 slurry400cm hflowrate3mmblowthesettledbedwasmade 16 层析柱的使用及维护 柱的平衡 在装柱及做完一个层析后 用至少5倍柱体积的缓冲液平衡或柱的流出液的电导和pH稳定 柱的再生 用高离子强度的缓冲液 1MNaCl 洗脱或改变pH 17 在位清洗 CIP 离子性吸附的蛋白 Washwith0 5CV2MNaCl Contacttime15min 沉淀的 疏水性结合的蛋白及脂蛋白 1MNaClat40cm h 1 2hours 脂类及非常强结合的疏水性蛋白 2 4CV0 5 非离子去垢剂 或1 醋酸 1 2小时 使用梯度方式70 的乙醇或30 的异丙醇 2 4CV1 2小时 18 柱子的保存 0 15mol LNaAcpH4 020 ethanol0 01mol LNaOH0 05 sodiumazide 19 怎样获得好