16s rDNA 经典材料.doc

Normally, we used following primers to amplify bacterial 16S rRNA genes (27F and 1492R pair) and sequencing them (using other primers). The primer sequencs are all listed in the reference: - Lane DJ (1991) 16S/23S rRNA sequencing. In: Stackebrandt E, Goodfellow M (eds) Nucleic acid techniques in bacterial systematics. Wiley, Chichester, pp 115-17527F 5 AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3 PCR and sequencing, most eubacteria357F 5 CTC CTA CGG GAG GCA GCA G 3 Most eubacteria530F 5 GTG CCA GCM GCC GCG G 3 Most eubacteria and archaebacteria926F 5 AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG 3 Most eubacteria and archaebacteria1114F 5 GCA ACG AGC GCA ACC C 3 Most eubacteria342R 5 CTG CTG CSY CCC GTA G 3 Most eubacteria519R 5 GWA TTA CCG CGG CKG CTG 3 Most eubacteria and archaebacteria907R 5 CCG TCA ATT CMT TTR AGT TT 3 Most eubacteria and archaebacteria1100R 5 GGG TTG CGC TCG TTG 3 Most eubacteria1492R 5 TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T 3 PCR and sequencing, most eubacteria 1525R 5 AAG GAG GTG WTC CAR CC 3 PCR and sequencing, most eubacteria M=C:A, Y=C:T. K=G:T, R=A:G, S=G:C. W=A:T; all 1:1Any primers reverse complement sequence is its revers prime. For example:519R 5 GWA TTA CCG CGG CKG CTG 3 then519F 3 CWT AAT GGC GCC GKC GAC 5Hope this would useful to you and answered your question. And hope this would useful to many other people. Good LUCK, guys!以16S rRNA基因为靶基因设计或比较通用引物，用blast效果不太好。因为该基因含有很多高度保守区（9-10），且在很多细菌中都是多拷贝的，文献或设计的primers往往都能扩增出几乎所有的真细菌，因此，blast时会得到很多同源序列，尽管如此，还是有更多的序列或细菌被省略了。我设计或验证该UP时，是有目的地根据实验需要，从genebank中确定一些常见细菌的属，每个属选几个菌种，每个菌种选2-3个菌株，但一定要包括标准株（可参考文献），然后用MEGLINE进行序列，并与UP进行比较。设计完成后在拿UP与随意查的其他细菌进行比较验证。尽管需要分析的序列可能达近百个，可现在的计算机内存和速度，及宽带都很大，应该是很快的。细菌rRNA按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中，它的内部结构由保守区及可变区两部分组成。其分子内存在的可变区，显示出细菌不同分类等级水平上的特异性。16S rRNA(16S rDNA) 寡核苷酸的序列分析 首先， 16S rRNA 普遍存在于原核生物（真核生物中其同源分子是 18S rRNA ）中。 rRNA 参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的时间钟。其次，在 16S rRNA 分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。第三， 16S rRNA 的相对分子量大小适中，约 1 540 个核苷酸，便于序列分析。因此，它可以作为测量各类生物进化和亲缘关系的良好工具。分离菌株 16S rRNA 基因的分离较为简单。从平板中直接挑取一环分离菌株细胞 , 加入 100L 无菌重蒸 H 2 O 中 , 旋涡混匀后 , 沸水浴 2min, 12 000r min -1 离心 5min, 上清液中即含 16S rRNA 基因，可直接用于 PCR 扩增。分离菌株 16S rRNA 基因的 PCR 扩增和序列测定的一般步骤为： 16S rRNA 基因的 PCR 引物： 5-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3 ； 5-AAGGAGGTGA TCCAG CCGCA-3 。扩增反应体积 50 m L ，反应条件为 95 预变性 5min ， 94 变性 1min ， 55 退火1min ， 72 延伸 2min ，共进行 29 个循环， PCR 反应在 PTC-200 型热循环仪上进行。取 5 m L 反应液在 10g L -1 的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。 PCR 产物测序可由专门技术公司完成。测序得到 分离菌株 16S rDNA 部分序列，此序列一般以 *.f.seq 形式保存，可以用写字板或 Editsequence 软件打开，将所得序列通过 Blast 程序与 GenBank 中核酸数据进行比对分析 ( /blast ) ，具体步骤如下：点击网站中 Nucleotide BLAST 下 Nucleotide-nucleotide BLAST blastn 选项，将测序所得序列粘贴在“ search ”网页空白处，或输入测序结果所在文件夹目录，点击核酸比对选项，即“ blast ”，然后点击“ format ”，计算机自动开始搜索核苷酸数据库中序列并进行序列比较，根据同源性高低列出相近序列及其所属种或属，以及菌株相关信息，从而初步判断 16S rDNA 鉴定结果。遗传距离矩阵与系统发育树构建，可采用 DNAStar 软件包中的 MegAlign 程序计算样本间的遗传距离。由 GenBank 中得到相关菌株的序列，与本研究分离菌株所测得序列一起输入 Clustalx1.8 程序进行 DNA 同源序列排列，并经人工仔细核查。在此基础上，序列输入 Phylip3.6 软件包，以简约法构建系统发育树。使用 Kimura 2-parameter 法，系统树各分枝的置信度经重抽样法（ Bootstrap ）500 次重复检测， DNA 序列变异中的转换和颠换赋于相同的加权值。16S rDNA是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其种类少，含量大（约占细菌RNA含量的80），分子大小适中，存在于所有的生物中，其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。在大多数原核生物中rDNA都具有多个拷贝，5S、16S、23S rDNA的拷贝数相同。16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。细菌的16S rDNA的结构如下：5 V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 3540bp 970bp 1540bp图6-1 16S rDNA的结构可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定，和其他方法相比，16S rDNA序列测定分析更适用于