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唾液淀粉酶最适pH值测定的论文姓名：林冠能 地址： 广西医科大学基础医学院临床医学2012级4班摘要：了解唾液淀粉酶的最适ph，把酶学知识应用于临床诊断与应用治疗。本实验目的是：1、 了解酶的最适pH的实验设计方法并掌握精测唾液淀粉酶最适pH值的方法，熟悉缓冲溶液的配置；2、 722分光光度计的使用。方法：相同时间内，在温度、酶浓度相同、pH值不同的条件下，酶的活性不同，水解的淀粉量不同，剩余的淀粉与过量的碘液生成的颜色不同，通过测定碘液与淀粉的不同程度水解的产物反应后的吸光度，得出酶的最适pH。结果：最适pH约为6.6。关键词：淀粉酶、pH、吸光度前言：酶无论在生活中还是在医学领域都有很大的研究意义，研究酶可以很好地应用酶，并可以更好地发挥出它的各种特性，在各种领域能得到广泛的应用。影响酶反应活力的因素很多，影响胞外酶的因素主要包括PH值、温度和金属离子、抑制剂及其他小分子，以及酶浓度等因素。PH值对酶反应活力的影响：1、酸或碱可以使酶的空间结构破坏，引起酶的活力丧失，这种丧失活力可能是可逆的或者是不可逆的，对可逆的来说，改变PH值后可使活力恢复，既具有复性。2、酸或碱影响酶的活性部位催化基团的离解状态，使得底物不能分解成产物。3、酸或碱影响酶的活性部位结合基团的离解状态，使得底物不能和它结合。4、酸或碱影响底物的离解状态，或使底物不能和酶结合。由于上述各种原因，各种酶的作用都有一个最适合的PH值范围。正文：一、实验试剂与仪器1、 试剂试剂：0.2mol/LNa2HPO4、0.2mol/LNaH2PO4、2.5g/L淀粉、唾液、碘液、蒸馏水2、 仪器仪器：吸量管（1mL、5mL）、小烧杯、移液器、试管、试管架、722型分光光度计、恒温箱、洗耳球、pH试纸等二、实验原理：ph的改变对酶的催化影响很大，酶催化活性最高时，反应体系的PH值称为最适PH值。本实验用唾液淀粉酶为材料来观察酶活性受ph影响的情况。淀粉被分解越多，剩余底物越少，A值最小，过酸或过碱会抑制酶的活性，使底物分解减少，A值增大。碘液与淀粉的不同程度水解的产物反应呈不同颜色，即：淀粉（蓝色）、紫色糊精（紫色）、红色糊精（红色）、麦芽糖及葡萄糖（黄色）。1利用朗伯比尔定律，用分光光度计测量出各溶液在660nm处地吸光度A，从而间接测出唾液淀粉酶的最适PH值。A在ph值6.08.0内范围变化，并且随着ph的增大而先减少后增大，ph=6.2左右，吸光值最低，所以唾液淀粉酶最适ph值约为6.2。三、 实验步骤： 1. 不同pH缓冲液配制 2. 唾液的获取 3. 淀粉用量确定 4. 酶液稀释倍数确定 5. 最适pH确定1. 不同pH缓冲液配制按下表加样，最后加蒸馏水稀释至10ml。pH 0.2mol/L Na2HPO4 (ml) 0.2mol/L NaH2PO4(ml)6.0 0.615 4.3856.2 0.925 4.0756.4 1.325 3.6756.61.8753.1256.8 2.450 2.5507.0 3.050 1.9507.2 3.600 1.4007.44.0500.950注：配好后用pH试纸检验所配制缓冲溶液的pH值2. 唾液的获取 先漱口12次，然后含一大口水约1min，期间做咀嚼运动，然后收集至杯子中。3. 淀粉用量确定 （单位:ml） 试剂 1 2 3 空白7.0pH缓冲液 0.9 0.9 0.9 0.92.5g/L淀粉 0.1 0.2 0.3 -唾液（稀释10倍）0.1 0.1 0.1 0.1混匀，37水浴5min，然后向每管加2滴碘液H2O 5.9 5.8 5.7 6.0混匀，观察现象，并选择适中一支（颜色最浅），记录其用量4. 酶液稀释倍数确定稀释倍数酶液与H2O的相关用量稀释倍数 5 10 15 20 25 酶液（ml）1.00.5 0.4 0.25 0.2 H2O（ml） 4.04.5 4.6 4.75 4.8 酶液最适稀释倍数按下表操作选取稀释倍数 5 10 15 20 25空白7.0pH缓冲液 0.90.90.90.90.90.92.5g/L淀粉 由第3步操作确定-唾液 0.10.10.10.10.10.1混匀，37水浴5min，然后向每管加2滴碘液H2O 6.0 6.06.06.06.06.0混匀，观察现象，并选择适中一支(颜色最浅)，记录其稀释倍数5. 最适pH确定试管号 1 2 3 4 5 6 7 8pH 6.0 6.2 6.4 6.66.8 7.0 7.2 7.4pH缓冲液 0.90.9 0.9 0.90.9 0.9 0.9 0.92.5g/L淀粉 由第3步操作确定某倍数唾液 0.10.1 0.1 0.10.1 0.1 0.1 0.1混匀，37水浴5min，然后向每管加2滴碘液 H2O 6.06.0 6.0 6.06.0 6.0 6.0 6.0混匀，用蒸馏水调零，测定A660 A660 0.334 0.313 0.312 0.284 0.333 0.358 0.394 0.453以A660为纵坐标，pH为横坐标作图。找出唾液淀粉酶的最适pH值。四、 实验结果;见上图，吸光度A最低时所对应的pH值为6.6，即最适pH值=6.6五、 讨论1、如果底物太少，与碘液无现象，不能判断实验结果；如果底物过多，碘的颜色太深会掩盖实验反应出来的现象，所以要取浓度适中的底物浓度。2、本实验中，当唾液淀粉酶的活性最大时，淀粉被分解得最多，剩余底物的量最少，A值最小，过酸或过碱均会抑制酶的活性，使之分解的底物减少，A值增大。3、最适PH不是酶的特征性常数，它受底物浓度、缓冲液种类与浓度以及酶纯度等因素的影响。溶液PH高于或低于最适PH时，酶活性降低，分解的底物就会减少。4、如果远离最适PH较远时还会导致酶变性而失活。在测定酶活性时，应选用适宜的缓冲液以保持酶活性的相对恒定。参考文献：参考文献：1吴耀生 医学生物化学与分子生物学实验指南人民卫生出版社2查锡良、周春燕 生物化学第7版北京：人民卫生出版社2008.1：753石渊渊生物化学实验指导M 开封：河南大学出版社4张杰技术.第1版北京：北京大学医学出版社2006.12：276、235、345、李淑艳.医学化学实验5许冰，原媛，赵文献河北钢铁集团邯钢医院西院,河北省邯郸市,056003临床合理用药杂志6杨玉萍.YANGYu-ping几种环境条件对唾液淀粉酶活性的影响期刊论文-新乡学院学报（自然科学版）7陈电容生物化学与生化药品M郑州：郑州大学出版社，2004：288尚渤程(云南省昆明市第一中学6s0031)黎一苇(云南大