中药色谱指纹图谱方法学薄层色谱PPT课件.ppt

1 2 薄层色谱操作规程 2 自动多次展开 全自动定量点样 3 4 薄层指纹图谱报告 5 简单操作组合 供试品溶液制备 手工半定量点样 玻璃双槽展开箱展开 显色 直观观测 可见光及紫外光 判断样品指纹谱相似度 拍摄色谱图像照片记录 6 复杂操作组合 供试品溶液制备 计算机控制半自动或全自动定量点样 玻璃双槽展开箱展开或自动展开箱展开 显色 直观观测 可见光及紫外光 拍摄色谱图像照片记录 数码成像及数据处理 薄层扫描 积分数据 计算机相似度评价 7 3 薄层色谱的规范化 1 器材的规范化固液萃取小柱 定量微升毛细管 标准展开箱或双槽展开箱 预制薄层板 展开条件控制槽 紫外光灯 显色喷雾器或浸渍显色用玻璃缸 薄层色谱扫描仪 半自动薄层点样器 计算机控制 参数可与薄层扫描仪共享的全自动薄层点样器 自动展开箱 薄层色谱成像及图像处理系统 8 2 操作规程的规范化点样 展开 显色 3 供试品溶液的预处理 杂质 对待测的活性成分或指标成分形成干扰 不经预处理 很难得到清晰明确的结果 例方法 A 加热回流B 超声提取C 液液萃取D 固液萃取 样品的提取液通过固相小柱处理 吸附 键合相分配 正相 反相 离子对 离子交换原理富集待测组分 去除部分杂质 9 如雪莲花 甲醇提取液 不经净化处理 色谱的可见光或荧光图像与经预处理 18小柱洗脱 的图像比较 很显然经过预处理将杂质去除后色谱图像质量明显提高 10 4 展开溶剂的选择展开剂 薄层色谱的关键展开剂优化 依靠经验展开剂要求 分离度高 斑点多 展开剂最优化模式难以计算 1 样品中多类别成分共存 优化模式难以外延 2 溶剂蒸气在展开中起着举足轻重作用 但又难以获得可测量的参数 鉴别判断信息多 11 5 溶剂蒸气对色谱行为的影响薄层色谱 开放 环境下展开 展开剂蒸气也参与展开全过程 展开前蒸气预平衡调整蒸气浓度保持展开溶剂新鲜度 改善色谱质量 12 黄连溶剂系统 苯 醋酸乙酯 甲醇 异丙醇 28 氨水 6 3 1 5 1 5 0 25 S1 检测 置紫外光灯 365nm 下检视 图黄连的荧光薄层色谱图1 巴马汀 2 小檗碱 3 表小檗碱 4 黄连碱 5 6 味连 7 8 雅连 9 10 云连 11 12 商品黄连 13 药根碱 14 非洲防己碱 13 S1中浓氨液的蒸气相在色谱中起了关键作用 A仅用S1预平衡15min 氨蒸气量不足 药根碱 非洲防己碱 巴马汀 小檗碱均不能分开 B改用浓氨水5ml在一侧槽中预平衡15min后展开 则药根碱 非洲防己碱 巴马汀 小檗碱均得到分离 CS1中除去浓氨水 仅用浓氨水预平衡 色谱分离度仍很差 DS1中浓氨水改为水 一侧槽中用浓氨水平衡 分离效果同B 14 大黄游离蒽醌薄层色谱分析 展开剂为石油醚 30 60 甲酸乙酯 甲酸 15 5 1 用新鲜开瓶的甲酸乙酯时 5种游离蒽醌分离度很好 若用反复多次开瓶使用的甲酸乙酯时 由于甲酸乙酯吸收了空气中水分而或多或少分解而导致色谱的分离度大大降低 或配好的展开剂反复多次使用 各溶剂比例改变 色谱重现性差 1 芦荟大黄素2 大黄酸3 大黄素4 大黄素甲醚5 大黄酚 15 6 环境因素的影响相对湿度 分离度 牛胆汁 RH72 四种分不开 温度 分离度和Rf值三七药材中的三七皂苷R 与人参皂苷Re只有在低温 10 才能分开 16 17 实例 人参类药材薄层色谱指纹图谱1 试验材料及仪器 1 对照品人参皂苷Ro Rbl Rb2 Rb3 Rc Rd Re Rf Rgl Rg2 F2 伪人参皂苷F11 三七皂苷 Rl 2 薄层板自制硅胶板 预制硅胶60F254板 20cm 20cm 高效板10cm 10cm Merck 3 仪器Nanomat 点样器及全自动点样器 双槽展开缸 VARIO KS展开槽 HPTICVARIO展开槽 薄层色谱条件控制槽 薄层扫描仪 均为瑞士CAMAG产品 HP9482薄层色谱扫描软件 CATS薄层色谱扫描及评价软件 CAMAG 薄层色谱摄像仪 Reprostar CAMAG 18 4 试药氯仿 精制 重蒸 乙酸乙酯 正丁醇 甲醇 分析纯 5 供试品吉林生晒参 吉林红参 新开河红参 三七 高丽红参 高丽白参 高丽曲参 美国西洋参 加拿大西洋参 国产引种西洋参 2 样品预处理 1 供试液1样品 甲醇 回流提取 提取液 浓缩至近干 水溶解 正丁醇萃取 正丁醇液 减压蒸干 五氧化二磷真空干燥器中干燥 总皂苷 加甲醇溶解 使成每1ml含总皂苷8mg 西洋参 三七为4mg 作为供试液 19 2020 1 7 20 2 供试液2甲醇回流液 适当浓缩 碱性氧化铝小柱 50 甲醇洗脱 洗脱液 减压蒸干 残渣 加水溶解 水溶液 Sep PakC18小柱 甲醇洗脱 甲醇液 蒸干 残渣 甲醇溶解 使每1ml含8mg 人参总皂苷 或4mg 西洋参或三七总皂苷 作为供试液 除去人参皂苷Ro 特别因用预制板时 人参皂苷Ro与人参皂苷Rbl或Rb2重叠 3 点样用微升毛细管分别吸取人参皂苷混合对照品甲醇液 4mg ml 人参 西洋参 三七供试液各1 l 点样于硅胶板上 原点直径 2mm或各吸取0 2 l点样于高效板上 21 原点直径 1mm 或Linomat点样设备或全自动点样器 ATS3 条带状喷雾点样于预制板上或高效板上 置五氧化二磷真空干燥器放置过夜 展开前置薄层板于Vario KS槽中于相对湿度42 48 条件下预平衡15min 4 展开于双槽展开箱的一侧加入展开溶剂氯仿 乙酸乙酯 甲醇 水 15 40 22 10 8 10 放置过夜 分取下层 S 1 20ml 20cm 20cm 或8ml 10cm 10cm 预平衡15min 放入薄层板展开 常规板展开14cm 高效板展开7cm 展开温度10 25 Merck预制板25 28 展开箱内相对湿度控制在42 45 22 5 显色及扫描用5 硫酸乙醇液喷雾或浸渍 预制板 100 105 加热至斑点显色清晰为度 于可见光下观察红色至红紫色斑点 或条带 紫外光灯 366nm 下观察紫红色荧光 人参二醇型皂苷 或橙色荧光 人参三醇型及奥可梯隆型皂苷 斑点 或条带 为了加强荧光强度 可于显色后 再喷雾或浸渍液体石蜡 己烷 1 1 混合溶剂 扫描 荧光方式 ex366nm 滤光片K400 23 6 关于方法学 1 溶剂系统的优选文献报道最常用的溶剂系统有 氯仿 甲醇 水 65 35 10 下层 S 2 正丁醇 乙酸乙酯 水 4 l 5 上层 S 3 氯仿 乙酸乙酯 甲醇 水 2 4 2 1 下层 S 4 氯仿 正丁醇 甲醇 水 20 40 15 20 下层 S 5 5种展开溶剂系统比较试验结果 S 1及展开条件得到的人参皂苷色谱分离度好 斑点容量大 18 斑点相对位置重现性好 RSD 1 3 24 25 自左至右 Rbl Rb2 b3 Rc Re NR 1 Rd Rg1 Rf F11 F2 Rg2 混合对照品 西洋参 人参 人参 RblRb2RcReNR 1RdRg1RfF11F2Rg2混西人参人参b3 26 Rf Rg1 Rc 27 2 相对湿度 RH 及温度 AT 对人参皂苷色谱行为的影响取硅胶板纵向等距离分隔成5列 点样后在展开箱内分别以RH32 42 47 58 65 72 六种条件预平衡20min S 1展开 结果分离度随RH降低而提高 RH32 时最佳 28 RH32 42 47 58 65 72 29 展开时温度 用S 1于10 及28 分别展开 温度高 斑点位置抬高 斑点扩散 溶剂系统配制时放置分层的温度也很重要 25 以上放置混合溶剂不分层 展开效果很差 如在低于分层温度下展开 则溶剂系统脱混 色谱扭曲变形 经比较5 10 分层 10 25 展开为宜 28 不分层 10 以下 10 28 10 18 27 30 3 显色及扫描方式的选择文献多用30 5O 硫酸喷雾显色 经改进为5 10 硫酸乙醇液喷雾或浸渍后 立即加热显色 以免斑点在原位扩散 Merck预制板用浸渍法显色 扫描方式由通常用的可见光扫描改为荧光扫描 灵敏度提高9倍以上 Rbl Re Rgl的最低检出量为0 02 0 04 g A 荧光扫描B 可见光扫描 31 7 指纹图谱分析 32 生晒人参 高丽红参 西洋参 33 人参皂苷指纹图谱分区段图以B区 5 Re 6 未知峰 7 RdC区 8 9 10 F11 11 F2 12 Rg2 13 三七皂苷R1 Rbl Ra Rb2Rb3 Rc Rg1 Rf 微量皂苷14 18号峰 34 1 总体分析西洋参指纹谱较人参简单 主要皂苷斑点很明显 荧光强 微量皂苷斑点不易察见 人参指纹谱斑点多 微量皂苷易察见 尤以红参为明显 西洋参皂苷扫描图的各峰的总积分面积高于人参皂苷各峰的总面积 三七的指纹图谱以Rbl Re 重叠三七皂苷R1 Rgl最突出 2 群组分析薄层色谱扫描图可分辨出18个以上的峰 斑点 将各个人参皂苷峰分四个区段 宏观比较 以峰高计 西洋参色谱中A B区占优势 D区较难察见 林生参之C区较园种参明显 D区斑点极弱 人参 生晒参 红参 高丽参 四个区段的峰均可察见 D区峰较西洋参明显 尤以红参明显 吉林生晒人参一般A区 B区 C区 红参A区 B区 C区 D区的峰比生晒参更明显 35 生晒参红参高丽参西洋参 36 微观分析 西洋参色谱均呈一高 2 Rbl 一低 4 Rc 的二重峰 B区 A区 一高 5 Re 一低 7 Rd 的二重峰 林生参 或三重峰 5 6 7 C区特点是有8 Rgl 10 F11 11 F2 无9 Rf 12 Rg2 D区峰明显少而弱 比较稳定的是15号