常规分子生物学实验报告-绝对实用.doc

实验一 总RNA的提取1.1实验原理本实验采用试剂公司商品化的总RNA提取试剂盒。该RNA纯化系统采用RNA酶抑制剂,异硫氰酸胍(GTC)和-巯基乙醇,实验的整个操作都在冰浴条件下进行,这样就能显著降低RNA的降解速率。GTC和N-十二烷基肌氨酸钠的联合使用,促使核蛋白复合体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。然后根据Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法原理, 采用酸性酚-氯仿混合液抽提，再进一步从复合体中纯化RNA。低pH值的酚将使RNA进入水相,这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离。水相中的RNA可用异丙醇沉淀浓缩。进一步将上述RNA沉淀复溶于GTC溶液中，接着用异丙醇进行二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所有残留的蛋白质和无机盐。1.2操作步骤1.2.1细胞或组织破碎：植物组织破碎(适用的样品量为0.05g组织) (1)将1000ul变性液置于1.5ml离心管中,将此离心管放于冰浴中5分钟。 (2)将0.05克新鲜组织用液氮冰冻处理。 (3)在液氮下,研磨冷冻的植物组织块。 (4)待液氮挥发后,将上述分散的组织转移至无菌离心管(最好是预冷冻)中,匀浆破碎细胞。1.2.2 RNA的抽提(1) RNP的分离，向离心管内的组织液中加入1ml的裂解液，1530放置5分钟。(2) 加入200ul氯仿,剧烈振荡15秒，室温放置3分钟, 转移至无菌离心管离心,4，12000g,10分钟。(分三层)(3) 将上层水相吸至无菌离心管中+等体积70%的乙醇,混匀，转移到吸附柱中（洗涤除去其中的盐类），4离心，10000g,30秒，弃去废液。(4) 加入0.5ml的去蛋白液，再以4离心，10000g,30秒，弃去废液。(5) 加入0.7ml的漂洗液，4离心，10000g,半分钟，弃去废液。(6) 加0.5ml漂洗液,离心两分钟,弃废液.(7) 将离心柱转移到新的离心管中，加入50ul的DEPC水，静置2分钟，4离心，10000g,2分钟，收集离心下来的液体，即为所提取的RNA样品。1.3 结果 经过电泳图像分析大致共出现三条带，即28S、18S以及mRNA弥散带，结果表明RNA提取比较成功。1.3讨论 RNA的提取过程有五点最为关键，）样品细胞或组织的有效破碎；）有效地使核蛋白复合体变性；）对内源酶的有效抑制；）有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；5） 对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制RNA酶活性。故应做到：1、研磨组织块用于RNA提取的样品,必须是新鲜的细胞或组织,如采样后,不能立即用于提取则样品应用液氮速冻并贮于-70的冰箱中保存。2、变性液及相应的离心管需预冷。3、加入变性液后需用力摇动或上振荡器,摇动或振荡时间0.5-1min。4、在进行RNA提取的整个过程中要佩戴手套和口罩，防止认为的RNA酶污染，导致RNA的降解。所有要使用的器皿必须经过适当的处理才可使用。实验二 RT-PCR实验1.1实验原理利用RTPCR技术分离目的基因是目前基因操作中最有效的途径之一。RTPCR扩增产物经纯化、回收、与载体重组克隆，即可实现基因的分离。RT-PCR可由总RNA或mRNA作为模板，目前已经有多种操作方法。本实验采用“两步法”进行。（1）MMLV、MuLV(莫洛尼鼠反转录酶)，AMV(鸟成骨髓细胞性白血病毒反转录酶)/aq酶系统，在此系统中，先有反转录酶合成cDNA第一条链,随后灭活反转录酶,有Taq酶合成cDNA第二条链和进行PCR扩增。（2）TthDNA聚合酶/Mn,Mg离子系统，在此系统中，TthDNA聚合酶在不同离子缓冲液中表现为不同酶性质，在Mn离子缓冲液中，该酶表现为反转录酶性质，而在Mg离子缓冲液中又表现为聚合酶性质。因此操作中，先使系统处于Mn离子状态，有TthDNA酶反转录出cDNA第一条链，随后加入EGTA乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸鏊合Mn(因Mn的存在将抑制TthDNA 酶的聚合酶性质的发挥)，再将系统调整到Mg离子状态，有TthDNA酶合成cDNA第二条链及PCR扩增。1.2实验操作：总RNA及mRNA的提取（见实验一）：cDNA第一条链的合成 （1）：变性及退火 mRNA 11ul特异引物 1ul补水至 20ul90 1min 50 5min,冰浴 （2）按下表加入各反应成分 5扩增缓冲液 4l 种dNTP混合液 l 50mM MgCl2 1ulDTT 1ul RNA酶抑制剂 单位（1ul） MMLV 200单位(1ul) 加水至 20l （3）：42反应分钟（4）：于 加热分钟，灭活反转录酶3：PCR扩增 按下表加入： 0扩增缓冲液 5ul dNTP 1ul 上游寡核苷酸引物 10-50pmol(1ul) 下游寡核苷酸引物 10-50pmol(1ul) Taq聚合酶 2.5u(1ul) 加上至总体积 50l 加矿物油 50l4：在PCR仪上设定参数，进行PCR扩增、分析结果。 1.3讨论 1. RT-PCR能否有效地进行,依赖于模板mRNA的完整性和纯度。在操作中必须具备一个无RNA-酶的环境,实验过程中应该用消毒的离心管、吸液头,戴手套,用DEPC处理的水。如果要从核酸酶活性高的样品中分离RNA时,建议使用RNA酶抑制剂。2. 在使用此RT-PCR系统时,为了获得精确的实验结果,要求作模板的RNA,不管是总RNA、mRNA、还是合成的RNA,都要是无DNA的样品。系统中TflDNA聚合酶在系统规定的操作条件下,无反转酶活性,但是如果反应体系中含与模板有同样序列的微量DNA,则该酶会催化扩增出非实验所需的片断。3. RT-PCR反应中模板RNA的最小需要量,与模板RNA和引物片断的类型有关,对于系统提供的对照RNA模板,每一反应所需的最小量为10的3次方分子(2.5Zeptomoles，2.510-25mole)。为了使RT-PCR实验能获得较好的结果,要求,对于总RNA作为模板,这在每一反应中其量应为10pg-1g,而对于mRNA做模板则要求量为1pg-100ng。4. 在RT-PCR实验中,最好进行对照和空白对照反应,在进行对照反应实验时,反应体系中加入试剂盒提供的对照模板和对照上下游引物；在进行空白对照反应时,则采用灭菌的无DNA水代替RNA作为模板,用于反应体系。在实验中要特别注意防止各次实验之间样品与前次实验的残留核酸(DNA或RNA)的交叉污染。每次实验中扩增前的操作步骤应与扩增后的操作步骤最好有相互分开的工作区和取液器具。操作中最好使用能很好防尘的吸头。操作人员要戴上手套,并经常更换。实验中应用UNG或其他灭活技术处理以防止残留DNA被带入反应过程。5. 镁离子浓度 在RT-PCR反应系统中,由AMV逆转录酶和由TflDNA聚合酶催化的两步反应均需要镁离子,而这两步反应中所需的镁离子量且由反应体系中的核苷酸、寡聚核苷酸引物及模板的终浓度决定。反应体系中硫酸镁的使用浓度必须满足模板/引物的综合需求,虽然1-2.5mM的浓度的硫酸镁能基本满足大多数RT-PCR的要求,但镁离子浓度更进一步精确,将使逆转录和扩增过程灵敏度更高、专一性更强、质量更好。为了正确确定反应中所需镁离子的浓度,在正式实验前应先进行一系列平行实验,在这些平行实验中,在50l反应液中分别加入1,2,3,4,5,6l硫酸镁储液(试剂盒所带,25mM),然后比较各实验结果,以确定镁离子浓度。6. 引物设计 在操作中必须用特殊的引物来进行第一链的合成。这种引物与模板上一特定序列煺火,将模板上的某一段mRNA(而非整个样品mRNA)反转成cDNA。对于cDNA和基因组DNA的扩增差异来讲,前者的引物是与外显子而非内显子互补的。基因组DNA的扩增产物要比RT-PCR的产物大许多,这种长度上的差异不仅有助于在胶上将两者分开,而且更有助于cDNA的扩增产物的形成(因PCR在短片断的合成上更具优越性)。引物浓度是RT-PCR中应考虑的另一个引物方面的问题,我们建议开始时的引物浓度最好用50pmol(这样终浓度可为1M)。7. 模板 温度及循环数 RT-PCR反应中并不要求模板变形,如操作人员想加这一步,则应经模板/引物混合物与其他反应液分开,单独对模板/引物在94变性2分钟(AMV千万不能参与变性,否则将失活),然后再将其加入到RT-PCR的其他反应液中,在48保温。8. 引物的序列是PCR扩增中各温度设定时首要考虑的因素。常规的扩增过程为变性(94),煺火复性(42-60),延伸(68),如引物有高的Tm值,则可提高上述的煺火复性(42-60)和延伸(68)温度,煺火温度越高,非特异性扩增越少,特异性扩增越多。另外如上游引物的Tm低,则应降低煺火复性温度,使引物与模板能很好的煺火。9. 对于PCR循环数我们建议用40个,如模板RNA为稀有RNA,或量很少,则循环数可相应增加到45-50个循环。实验三 PCR片断的回收1.1实验原理目的DNA片段的回收技术是重组DNA中的关键技术，回收是指从电泳介质中纯化出目的片断。本实验采用的微量柱回收技术特别适合于PCR片段的回收，具有纯度高、操作简洁等特点，经此方法回收的片段可有效的用于重组载体构建。通过15分钟的纯化过程,PCR产物即能被有效地从含引物二聚体、非特异性扩增引物片断等混合物中分离出来，成为高度无盐的、不含其他大分子成分的纯化片断。在较宽的分子量范围内有较高的回收效率。下表为不同长度的DNA片断,在室温条件下,用此纯化系统直接纯化时,各自相应的回收率。dsDNA长度bp 20015003002007550回收率% 60969969321.2实验操作从琼脂糖凝胶介质中纯化PCR扩增的目的DNA片断1.用低熔点或常规熔点琼脂糖电泳对PCR扩增片断进行分离,该电泳安常规方法进行,缓冲液为TAE。2.在凝胶上,找到所需条带,然后用洁净并灭菌的小刀将其切下接近100微升琼脂糖凝胶 (约100毫克)，放入小离心管中。3.向加入离心管中加入300ul（凝胶体积的3倍）的溶胶液，50水浴10分钟，中间混匀两次。 4.为待回收片断准备好一个微量吸附柱。将所得到的混合液转入到此微量吸附柱上。然后再12000rpm离心30秒，弃去废液。5.向离心柱中再加入700ul漂洗液，12000rpm离心30秒，弃去废液。6.向离心柱中再加入500ul漂洗液，12000rpm离心30秒，弃去废液。7.将吸附柱放入另一个离心管中，再12000rpm离心2分钟，弃去废液。8.取出柱子，放到另一个离心管中，加入25ul洗脱液，室温静置20分钟后，再12000rpm离心1分钟，收集离心出的溶液，即为所需的样品。1.3实验讨论1对于3Kb的片断在纯化回收时,洗脱前,如先将水或TE缓冲液预热到65-80,则将能有效的提高回收率。待洗脱片断3Kb时,洗脱液温度应为65-80;待洗脱片断20Kb时,洗脱液温度应达80。2应用TAE缓冲液，而不应用含TBE的胶，因硼酸能与琼脂糖中的方式糖单体或多聚体结合成难溶复合物，这种复合物使胶难熔解。3在取用纯化柱树脂中的液体前,应将树脂充分搅匀,如树脂中出现结晶或结块,则应将树脂在25-37,温热10分钟,冷却至30使用。树脂本身不会溶。4在紫外光下观察切割条带时,操作要快，DNA条带在紫外光下的暴露时间应尽量短，因UV会引起DNA变异。5目前待回收的片断主要有酶切片断和各种PCR片断；回收的介质主要有琼脂糖和PAGE；回收的方法主要有树脂回收、微量柱回收、玻璃奶回收、液氮冻冻融回收及透析袋大量回收等。实验四 PCR片断的快速克隆1.1实验原理 T载体技术对于一些多克隆位点的可选择内切酶种类稀少的表达载体该技术特别适用。该方法具有不需对引物进行特殊酶切位点的修饰，即能直接进行PCR产物的克隆，并具有克隆效率高的特点。T-载体均是通过载体是通过用EcoR或SmaI等平末端酶将相关载体切割出平端,然后再在其两个3端加上T而构成的。这些存在于插入位点的突出的3末端可防止载体的自身环化,并为PCR产物提供碱基配对区（因PCR扩增产物的3末端为非特异性的A碱基）而有效地提高了PCR扩增片断的克隆效率。本实验中用pGEMR-T载体为材料，pGEMR-T载体来自于pGEM系统载体，这类载体中含有T7和SP6RNA聚合酶的启动子系列,该系列侧翼为一多克隆位点区,该区有-半乳糖苷酶的-肽端的编码区。-半乳糖苷酶的-肽编码区的插入失活,能使重组子在指示平板上通过颜色反应加以检测。此两个载体的多克隆位点区含有多种内切酶位点,此很容易来构建嵌套缺失位点。pGEMR-T Easy载体系统的多克隆位点两侧都存在EcoR、BstZ、Not,因此该载体可通过这三类酶进行单酶切构而建重组片断; 而pGEMR-T载体系统的多克隆区两侧都有BstZ酶切序列,因此用此酶进行单酶切操作,即可释放出可插入位点。除了单酶切外,这两类载体都可通过双酶切操作来形成插入位点。pGEMR-T及pGEMR-T Easy载体系统中都有嗜菌体f1的复制起始区,借此可以合成单链DNA。并可用双重反向启动子(T7,SP6)进行体外转录。在 pGEMR-T系列载体系统中,外源片断的克隆将打破载体中的半乳糖苷酶的编码序列,因此重组子可在指示平板上用颜色反应加以筛选。将外源片断克隆到pGEMR-T载体中,然后再转入感受态细胞,这样在指示平板上蓝白斑的比例将下降,在通常情况小,外源片断的插入将产生白斑,但在某些情况小,含重组子的载体也能形成蓝斑,这主要是插入片断长度(包括3A突出末端)为3核苷酸的倍数,且插入位点在lacZ基因的阅读框内,并插入片断不含终止密码子。这样就可能不破坏阅读框而翻译出含半乳糖苷酶N端多肽片断的融合蛋白,与宿主菌的C端片断发生-互补而形成蓝斑。1.2实验步骤（一）T载体的构建1.提纯载体DNA2.将1ug提纯的PGEM DNA用SmaI1ul进行全酶切（为了切割彻底、甚至能破坏酶切位点周围碱基序列而防止自连发生，酶可过量使用，并在25过夜）3.酚/氯仿、氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤，真空干燥复溶4.在上述酶切反应后复溶的含1ugDNA的Eppendof管中加入 10 PCR缓冲液 5 ul 10mM dTTP 10 ul 1mg/ml BSA 10 ul 5U/ul Taq酶 0.5ul 加水至50ul 702小时，酚/氯仿、氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤，真空干燥复溶（二）PCR产物的T载体克隆1.PCR产物的纯化2.按下述比例进行连接反应 反应体系 10T4DNA连接酶缓冲液 1 T载体 1 PCR片断回收产物 7.5 T4DNA连接酶（3u/ul） 0.5 加水至10ul 3.将反应体系轻轻点动混匀后，4连接过夜。4：T载体与外源片断连接后的转化见后面的实验十和十一1.3讨论1.在室温下,缩短保温时间,也可能是有效的操作方法,但这有可能降低克隆数。最适的连接条件为4过夜，因PCR产物与T载体间的配对碱基少，高温不利于连接的进行。经验表明如连接反应高于15，则兰斑数大大升高，可能T载体中存在没有加上T的载体，高温下平端自连的比例增加。2.连接酶最好用相关的经修饰纯化的T4DNA连接酶,因其他连接酶可能具核酸外切酶的活性,这样如用这种酶就有可能导致对载体3T产生切割。3.T4DNA连接酶的10缓冲液中含ATP,在温度频繁波动时,此成分有可能被降解,因此要避免仅为了少量使用而对缓冲液反复冻融。如果在融化后的T4DAN连接酶10缓冲液中出现沉淀,则应将此缓冲液振荡,以使沉淀复融。4.重组T载体转化时最好用SOC培养基,LB培养基也能用,但转化数可能低。5.因含半乳糖苷酶的菌落生长速度慢于无此酶活的菌落,因此保温过夜后,蓝斑菌落要远小于白斑菌落,白斑菌落的直径近1毫米。6.有文献报道当重组的外源DNA片断接近2Kb时,其可能会克隆到阅读框,并产生蓝斑。即使实验中预设扩增片断并非3核苷酸倍数,但扩增过程可能会导致核苷酸突变(缺失突变或点突变),这种片断与 pGEMR-T系列载体重组后,再转化到感受态细胞中后,即有可能产生蓝斑。这点已有文献报道，因此在筛选重组菌斑时要特别注意。实验五 染色体DNA的提取1.1实验原理 通过液氮研磨粉碎植物组织、裂解液裂解细胞、有机溶剂抽提，使进入水相的核酸与蛋白成分分开，在RNA酶作用下，降解RNA，得纯度较高的DNA样品。1.2实验操作 （1） 植物材料1g(鲜组织) 在液氮中,研碎（2） 700ul的裂解液GP1(含1/10体积酚,65预热，水浴20分钟), （3） 加入等体积氯仿,轻摇,30分钟 （4） 离心(12000-15000rpm, 15min )（5） 抽取水相的上清液转移到新管中 （6） 加入700ul的GP2溶液，混匀（7） 将溶液转到CB3柱中，先加入700ulGP2溶液，13000rpm，离心30秒，弃去上清（8） 再加500ul去蛋白液GD，13000rpm，离心30秒，弃去上清（9） 再加入700ul的漂洗液GW，13000rpm，离心30秒，弃去上清（10） 再加入500ul的漂洗液GW，13000rpm，离心30秒（11） 将柱转到新的空管中，继续13000rpm，离心5分钟,室温放3分钟.（12） 向柱中加入EB溶液50-200ul，静置4分钟,13000rpm离心1分钟,收集得到的样品。1.3结果鉴定所提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳胶分析，紫外观测仪观测，采用凝胶成像系统拍摄，得到清晰的DNA片断条带，保存图片结果。同时进行当OD260/OD280=1.8 为纯样1.4讨论（1） 在DNA提取过程中应做到A 根据不同研究需要，保证结构的相应完整性；B 尽量排除其它大分子成分的污染(蛋白质、多糖及RNA等)；C 保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。（2） 裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解（3） 各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解（4） 取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰.（5） 异丙醇,乙醇.NaAC,KAC等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。（6） 本方法适用于以DNA片段的酶切分析、Southern印迹等中，具有快速、省时、省线的特点，但所提DNA完整性不强，一般不适用于基因组文库构建（7） 此方法也适合菌类基因组DNA的大量提取.实验六 质粒DNA提取和纯化1.1实验原理（1） 碱解法提取质粒DNA，本方法适合于质粒DNA的微量提取。（2） 整合外源DNA并将其带入宿主细胞的过程是分子克隆的关键。而在此过程中携带外源基因的工具为载体。克隆操作是将待克隆片断先克隆到通用大肠杆菌载体的多克隆位点区，或直接测序或根据需要再克隆到其他载体上。（3） 大肠杆菌质粒多为一些双链、环状的DNA分子，其大小范围从1Kb-200Kb以上不等，它们是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒的存在能赋于菌体一些特殊的表型，这些表型主要有对抗生素的抗性、修饰酶等。1.2操作步骤（1） 含氨卞（100ug/ml）的LB培养基 培养菌体 37 200rpm 过夜（2） 含氨卞的LB培养基 培养菌体 37 200rpm 34小时至OD600到0.4-0.6，吸取1.5ml（3） 离心， 13000rpm,1min（4） 收集菌体沉淀( 充分去除LB培养液)（5） 加入预冷的250ul Solution ,充分振荡悬浮（6） 加入250ulSolutionII,颠倒徭匀后冰浴中3-5min,（7） 加入350ul预冷Solution III混匀, 冰浴5min（8） 离心,13000g,4,2min（9） 取上清,加入吸附柱中.（10） 再离心，13000rpm，3分钟（11） 上清700ul的洗液,室温,5min, 离心,13000rpm,4,1min（12） 取沉淀，再加500ul洗液，离心13000rpm，4,1min（13） 13000rpm,空离4分钟.（14） 悬于50l100ul的洗脱液中（15） 再离心13000rpm，4,1min，收集质粒DNA样品。（16） 取10ul样品点样电泳鉴定（17） 剩余样品，-20保存备用。 1.3讨论.试剂中所用葡萄糖有增加粘度，降低剪切率，减少DNA的降解 .试剂中所用EDTA有抑制DNase的作用，还能降低离子浓度，而高浓度离子对溶菌酶有抑制作用。 .试剂中所用NaOH能使DNA变性，KAC能使DNA复性，并有助于蛋白等其它大分子成分沉淀。 4 .如A,不用酚/氯仿抽提;B,LB培养基残留；C，提取中在溶液II中时间过长，导致共价闭合环状DNA不可逆变性，则可能影响酶切。5 .质粒提取方法还有很多，如要进行重组质粒的植物转化或质粒测序则应进行氯化铯梯度离心，或直接采用试剂盒提取。另试剂盒提取可同时进行许多质粒的提取，能在最短时间内获取高质量、高浓度的质粒DNA6.载体因具有通用引物序列、多克隆位点区具极多载体有1） 在宿主细胞中独立复制能力；2） 带抗性等选择标记；3） 有合适的限制性内切酶位点，可插入一定片断长度的外源DNA而不影响自身复制的特点。7 .目前经基因操作已构建了一大批适合不同宿主细胞，有不同选择标记的克隆载体或表达载体。这些载体有以下几类：1) 宿主为大肠杆菌的质粒、Lamda噬菌体、噬菌粒、噬菌体M13、粘粒和卡粒等；2) 宿主菌为酵母的以酵母人工染色体克隆系统（YAC）为代表的酵母菌质粒载体及酵母菌与大肠杆菌穿梭质粒载体；3) 以枯草杆菌为载体的枯草杆菌质粒载体和芽雹杆菌与大肠杆菌的穿梭质粒载体4) 宿主为植物细胞的Ti质粒、植物病毒及带有正核启动子的改造质粒；5) 动物细胞为宿主的动物病毒和以动物病毒为基础改造的穿梭质粒。8.质粒DNA的提取根据实验目的不同，可以有不同的方法，但基本步骤多为三步：第一 细菌培养和质粒的扩增，第二 细菌菌体的裂解，第三 质粒DNA的纯化。菌体裂解方法不同，决定了质粒DNA提取方法的差异，目前菌体裂解方法主要有煮沸法，SDS法，碱解法,Triton-溶菌酶法等。9.质粒DNA的纯化方法主要有梯度离心法、柱层析法等，10.在质粒DNA提取中，质粒DNA的质量和产量在很大程度上受培养条件的影响,通过一些实验发现,下列培养方式能获得较好的结果 （1） 培养应用菌龄不超过4天的平板单菌落作为起始菌 （2） 培养菌应在37,220rpm下,生长16-18小时 （3） 不能用经储藏的培养菌直接进行质粒提取制备（4） 如果要提取大质粒DNA则建议使用溶菌酶裂解细胞，以释放质粒DNA实验七 DNA片断的酶切1.1实验原理限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶,该类酶是体外剪切基因片段的重要工具，基因物理图谱的绘制、核苷酸序列的测定、基因片段的重组，转化菌中重组子的筛选、探针的制备及各种杂交、测量基因的拷贝数,基因文库构建,等都离不开限制性内切酶的应用。另外以限制性内切酶为基础的各种限制性内切酶片段长度多态性分析，促进了分子遗传学、分类学等相关学科的应用和发展。本部分实验主要学习掌握通过EcoR，Hind III两种限制性内切酶对DNA的单酶切、双酶切及部分酶切的操作1.2实验操作EcoR 、Hind III双酶切DNA、染色体DNA和质粒DNA 1. 取3支干净、灭菌新Eppendof管，按下表加入（ul） DNA 染色体DNA 质粒DNA灭菌水 14 12/10* 12 缓冲液 2 2 2 模板DNA) 2 4/6 4 EcoR 1 1 1 HindIII 1 1 1 总体积 20 20 20 （注*：根据所提取的染色体DNA量而定） 2. 37保温23小时 3.保温结束后65-7010min灭活酶(如为热稳定性酶,则用氯仿抽提) 4.取4l左右的反应液加入4l溴酚蓝混合均匀，点样，电泳分析酶切结果。 1.3讨论.样品加入次序为水、缓冲液、模板DNA最后为酶，不应颠倒， .加酶步骤要在冰浴中进行，在加酶前应先将水、缓冲液及待切DNA混匀 .反应体积中水的量要尽量少，即反应体系的体积要尽量少，一般水解0.2-1ug模板DNA时，应将体积控制在2030ul内。但要保证所加酶的体积不高于总体积的1/10,因为限制性内切酶是保存于50%甘油中的，如加酶体积高于总体积的1/10,则反应液中甘油浓度将大于，而此浓度将抑制内切酶活性。 4 .为了控制反应体积和促进反应进行，要求模板DNA的浓度应很高，否则反应体系中DNA浓度太低则将引起酶反应动力学改变、降低酶解效果，此时不得不增加反应体积；而一般为了增加DNA储藏的稳定性，DNA多保存在TE缓冲液中，如反应体系中过多加入模板DNA溶液则势必造成反应体系中EDTA浓度升高，而对酶产生抑制。因此如底物DNA浓度过低则应进行浓缩。 5.本实验中双酶切时，因两种酶的缓冲液盐浓度要求相同，所以，可在同一反应体系中完成双酶切。但如进行双酶切时，两种酶所需缓冲液盐浓度要求不同，则不能将两种酶同时加入同一体系，进行反应，此时可采取下列处理办法 a:先用在低离子强度的缓冲液中活性最高的酶切割DNA，然后加入适量的NaCl及第二种酶，继续保温。b:使用所有限制酶均可作用的单种缓冲液(谷氨酸钾缓冲液)。c:一种酶水解完后，进行有机溶剂抽提，沉淀、干燥后再复溶然后进行第二种酶切。在上述3种方法中遇到最多的可能为C 6.在水解结束灭活酶时可采用65加热10分钟或加EDTA至终浓度10mM，二者各有利弊，加热简单但对有些酶灭活不彻底。EDTA对酶的灭活彻底，但EDTA存在将使连接反应变得极为困难，因此在连接前要求重新用有机溶剂抽提，这将增加操作难度和导致DNA的损失。实验八 DNA酶切片断的脱磷1.1实验原理 在对DNA片段的修饰中，脱磷酸化反应是一个重要内容,该反应有碱性磷酸化酶催化，该酶可使线状DNA上去除5磷酸基团，而DNA的脱5磷酸基团一方面是基因重组、载体构建中防止载体DNA自身联接、环化的重要途径，载体经单酶切线性化后,3端为羟基、5端为磷酸基，在连接酶作用下将以极大比例发生载体自连,而5脱磷后,载体在5与3位均为羟基不能自连只有与带5磷酸基的外源片断连接,载体与外源片断间形成一个磷酸二脂键和一个缺口,缺口在转移进细胞后修复.另外脱磷作用还可发生在RNA、DNA、三磷酸腺苷、脱氧三磷酸腺苷的5端，这个反应是进行探针标记操作中的重要环节。1.2实验操作 .在前实验所得DNA限制性内切酶片段中加入酶切片断DNA样品 16ul 10碱性磷酸酶缓冲液 10ul碱性磷酸酶(0.01u/pmol ends) 1ulddH2O 73ul总体积 100ul对于5突出则37下温浴30分钟,再加入1ulCIAP(0.01u/pmol ends), 37下温浴30分钟.对于平末端或3突出末端,则37下温浴15分钟,56下温浴15分钟, 再加入1ul CIAP(0.01u/pmol ends), 37下温浴15分钟. 56下温浴15分钟 .温浴结束后加入EDTA(pH 8.0)至终浓度分别为10mM，70加热20min，以灭活碱性磷酸酶 .补加水100ul，加入氯仿抽提上清，10000rpm，离心5分钟，取上清 .加入1/10体积NaAC，充分混匀，再加入体积的乙醇，70放置30分钟，再离心，12000g离心10分钟，取沉淀DNA。 .冷70%乙醇和1/10体积NaAC洗沉淀一次 .TE溶解（终浓度为100g/l），-20保存 .沉淀或用电泳缓冲液溶解，上样电泳分析。1.3结果鉴定 将脱磷片断中加入连接酶,以加入连接酶的非脱磷片断作为对照,连接反应后,Agarose电泳分析,脱磷片断不能连接,而非脱磷对照片断能连.1.4讨论1. pmol ends=3.04ugDNA/DNA的碱基数2.在上述几个实验中，有机溶剂沉淀时所用NaAC的pH最好为7.2或用7.5M的NH4AC，如用pH5.2的溶液则有可能导致EDTA沉淀量增加，影响以后的连接反应。3. 碱性磷酸酶有两类BAP（细菌碱性磷酸酶）和CIP（小牛肠道碱性磷酸酶），因BAP耐热，灭活时必须采用有机溶剂抽提法，而CIP在6810SDS条件下即可灭活，因此实验中一般都采用CIP。4 .条件的摸索需要预试验。实验九 DNA片断的连接1.1实验原理DNA酶切片段的连接是分子生物学实验中又一关键技术，该技术是基因重组，基因改造的重要中间环节。两DNA片段相邻的5磷酸和3羟基间可由连接酶催化形成磷酸二酯键，这个连接反应在体外一般都有大肠杆菌DNA联接酶和T4DNA连接酶催化，但分子生物学实验中主要采用T4DNA连接酶，因该酶在正常条件下，即能完成连接反应。连接反应可在溶液中进行也可在琼脂块中进行。在基因重组克隆中外源DNA与载体的连接是承上启下的一步操作。1.2实验操作 1.取干净、灭菌Ephondof管，安下表加入各试液T4DNA联接酶缓冲液 1ul载体DNA片断 1ng （3ul）插入目的片断 1ul连接酶 1u(平末端,如为粘端连接,则酶量可小于1u)加无菌水 4ulX=目的片断与载体片断的分子比例载体ng数目的片断的碱基数/载体ng数（目的片断/载体片断的分子比例一般为3/1）2.连接反应22保温3小时或4过夜(Promega连接酶,粘端连接)或22-261hr(BRL连接酶,粘端连接)或224-16hr(Promega连接酶,平端连接)或1416-24hr(BRL连接酶)1.3讨论1.粘端连接时模板DNA用量控制在0.1-0.5ug间，而平连时模板量应0.5ug。粘连时温度可在4 过夜，而平连时最好在1216过夜2. 用于转化的连接片断最好不要冰冻3 .胶内连接时，应用TAE缓冲液，而不应用含TBE的胶，因硼酸能与琼脂糖中的方式糖单体或多聚体结合成难溶复合物，这种复合物使胶难熔解，将抑制连接酶。4.在紫外光下观察切割条带时,操作要快，DNA条带在紫外光下的暴露时间应尽量短，因UV会引起DNA变异。5. 在分子生物学实验中连接酶主要用于1)基因重组中载体与外源基因的连接；2) 接头与DNA片断的连接，这种连接一般发生在文库构建、分子标记的AFLP及差异表达的研究等中。6.根据连接片断末端类型不同，连接方式有粘端连接、平端连接等和平粘端连接及单碱基配对的T载体连接。其中粘端连接的效率最高，粘端连接与平粘连接中外源DNA片断在载体中的插入有方向性。平端连接的效率最低，且载体发生自连的比例较高，因此在克隆操作中为了克服平连的弊端，通常可通过1)TdT酶在载体和外源DNA片断上转移一互补序列（核苷酸投影法）；2)在载体和外源DNA片断上加上人工接头，变平连为粘连。7. Buffer 中含有ATP， 故应分装防止ATP失活。实验十 感受态细胞的制备1.1实验原理当细菌处于容易吸收外源DNA的状态时，即为感受态，而用理化手段使细菌处于感受态的操作为致敏过程。感受态细胞制备是重组基因能否实现转化的一重要的技术关节。目前制备感受态细胞常用方法多为钙盐法或PEG法或电击法。1.2实验操作 .大肠杆菌在LB平板上划线培养12-16小时，挑取单菌落于LB培养基中摇瓶培养大肠杆菌到对数期(37 200RPM 3-4小时，如从冰箱中保存平板中挑取的菌落，则到对数期时间可能要到6-7小时) .取1ml培养物10000rpm,离心3min.收集菌体，冰浴放置 .用预冷的600ul氯化钙悬浮菌体，10000rpm,离心3min.收集菌体，冰浴放置 .用预冷的1000ul氯化钙悬浮菌体，冰浴15min，10000rpm,离心2min(可见一条线状条带).收集菌体，冰浴放置 .加入200l预冷氯化钙，放置于冰浴，即得感受态细胞,此细胞可现用(冰箱中放置12小时效率高),也可在4保存1周，或分装于无菌离心管中,投入液氮,快速冷冻然后储于-70保存1.3讨论在本操作流程的前几步中，每次离心后，应尽量将上清液去除干净，以防LB培养基的污染实验十一 重组体的转化1.1实验原理转化是指以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。目前用得较多的转化技术为将人工构建的重组质粒导入受体细胞，使重组质粒在受体细胞中稳定的复制和表达。要成功地进行转化实验，必须满足三个要求即，有一好的感受态细胞；，良好的转化环境；，待转化DNA应与受体细胞DNA有好的同源性。1.2实验操作1.现制感受态细胞可直接使用；冻存感受态细胞在手心缓慢融化.2. 加入待转化外源DNA(40ng左右)，冰浴30min。3. 42热冲击1分30秒4.冰浴5min5.加入1mlLB液体培养基，保温45分钟1小时。6.取20200ul菌悬浮液，涂布于有选择压力的LB培养基上（本实验中为100ug/ml的安卞青霉素培养基），保温过夜。7.计数，计算转化率。1.3讨论 1.对于有些宿主菌,在上述步骤中用SOC培养基代替LB培养基可能有更好的转化率. 2.选择压力培养基有待转化DNA所带抗性标记决定。 3.重组片断的筛选也可用培养基进行。 4.转化率：每ng DNA 转化后产生的菌落。实验十二 重组体的筛选1.1 实验操作在LB培养基上滴加100ul转化后菌体，再在菌液上滴加4ulIPTG（200ug/ml）和40ulX-gal(20ug/ml溶于二甲基甲酰胺)，涂布均匀，保温过夜后，培养基中的白班菌落即为重组克隆。实验十三 RAPD技术1.1实验原理RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA,随机扩增的多态性DNA)是建立于PCR实验基础上的检测基因组DNA多态性的实验技术。 该技术利用大量的、各不相同的、碱基顺序随机排列的寡聚单核苷酸链为引物，以待研究的基因组DNA片段为模板，进行PCR扩增。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳等分离，经染色后，即可对此基因组DNA进行多态性分析。1.2实验操作1：基因组DNA提取（见前面的实验） 2：取0.5mlEppondef管,加入 基因组模板DNA 40ng PCR扩增参数（94 预扩增5min） 10PCR缓冲液 2ul 94 变性 30秒 10M的dNTP 0.4ul 36 褪火 90秒 10mer随机引物 0.8ul 72 延伸 60秒 Taq酶(5u/ul) 0.2ul 40个循环，结束后，72延时10分钟 Mg离子溶液25mmol） 1.2ul加水至 20l 混匀后离心：扩增产物与电泳上样液等量均匀混和，1.5% Agrose胶电泳分析结果。实验十四 AFLP技术1.1实验原理AFLP是又一种建立在PCR基础上的限制性片断长度多态性分析，是一种重要而有效的分子标记技术。1.2实验操作1总DNA提取（见前面的实验）2DNA酶切连接 DNA模板（200ng/ul） 5ul Mse I 0.5ul（3U） Pst I 0.5ul（3U） 10T4 Buffer 2.5ul 酶切液