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07 01 2020 1 本章内容 RNA转录的基本过程转录机器的主要成分启动子与转录起始原核与真核生物mRNA的特征比较终止和抗终止内含子的剪接 编辑 再编码及化学修饰 07 01 2020 2 基因表达包括转录 transcription 和翻译 translation 两个阶段 转录是指拷贝出一条与DNA链序列完全相同 除了T U之外 的RNA单链的过程 是基因表达的核心步骤 翻译是指以新生的mRNA为模板 把核苷酸三联遗传密码子翻译成氨基酸序列 合成多肽链的过程 是基因表达的最终目的 07 01 2020 3 DNA分子中的核苷酸排列顺序不但决定了胞内所有RNA及蛋白质的基本结构 还通过蛋白质 酶 的功能间接控制了细胞内全部有效成份的生产 运转和功能发挥 与mRNA序列相同的那条DNA链是编码链 codingstrand 或称有意义连 sensestrand 另一条根据碱基互补原则指导mRNA合成的DNA链则被称为模板链 templatestrand 或称反义链 antisensestrand 07 01 2020 4 DNA模板与mRNA分子及多肽链之间存在共线性关系 07 01 2020 5 DNA和RNA虽然很相似 只有T或U及核糖的第二位碳原子上有所不同 但它们的生物学活性却很不同 RNA主要以单链形式存在于生物体内 其高级结构很复杂 它们既担负着贮藏及转移遗传信息的功能 又能作为核酶直接在细胞内发挥代谢功能 因为只有mRNA所携带的遗传信息才被用来指导蛋白质生物合成 所以人们一般用U C A G这4种核苷酸而不是T C A G的组合来表示遗传性状 07 01 2020 6 生物体内拥有三类RNA 编码特定蛋白质序列的mRNA 能特异性解读mRNA中的遗传信息并将其转化成相应氨基酸后加入多肽链中的transferRNA tRNA 直接参与核糖体中蛋白质合成的ribosomalRNA rRNA 07 01 2020 7 3 1RNA的转录的基本过程 无论是原核还是真核细胞 转录的基本过程都包括 模板识别转录起始通过启动子转录的延伸转录的终止 07 01 2020 8 模板识别阶段主要指RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合的过程 转录起始前 启动子附近的DNA双链分开形成转录泡以促使底物核糖核苷酸与模板DNA的碱基配对 转录起始就是RNA链上第一个核苷酸键的产生 I模板识别 07 01 2020 9 大肠杆菌中依赖于DNA的RNA转录过程图示 转录泡中单链DNA的长度约在17bp左右 被聚合酶复合物所保护的DNA序列约为35bp左右 07 01 2020 10 真核生物RNA聚合酶不能直接识别基因的启动子区 需要一些被称为转录调控因子的辅助蛋白质按特定顺序结合于启动子上 RNA聚合酶才能与之相结合并形成复杂的前起始复合物 preinitiationtranscriptioncomplex PIC 以保证有效地起始转录 07 01 2020 11 转录起始后直到形成9个核苷酸短链是通过启动子阶段 此时RNA聚合酶一直处于启动子区 新生的RNA链与DNA模板链的结合不够牢固 很容易从DNA链上掉下来并导致转录重新开始 II转录的起始 initiation 07 01 2020 12 一旦RNA聚合酶成功地合成9个以上核苷酸并离开启动子区 转录就进入正常的延伸阶段 所以 通过启动子的时间代表一个启动子的强弱 一般说来 通过启动子的时间越短 该基因转录起始的频率也越高 07 01 2020 13 RNA聚合酶离释放 因子 核心酶沿DNA链移动并使新生RNA链不断伸长的过程就是转录的延伸 大肠杆菌RNA聚合酶的活性一般为每秒50 90个核苷酸 随着RNA聚合酶的移动 DNA双螺旋持续解开 暴露出新的单链DNA模板 新生RNA链的3 末端不断延伸 在解链区形成RNA DNA杂合物 III转录的延伸 elongation 07 01 2020 14 当RNA链延伸到转录终止位点时 RNA聚合酶不再形成新的磷酸二脂键 RNA DNA杂合物分离 转录泡瓦解DNA恢复成双链状态RNA聚合酶和RNA链都被从模板上释放出来 IV转录的终止 termination 07 01 2020 15 37 时 转录生成mRNA的速度大约是每分钟2500个核苷酸 即每秒钟合成14个密码子 而蛋白质合成的速度大约是每秒钟15个氨基酸 正常情况下 从一个基因开始表达到细胞中出现其mRNA的间隔约为2 5分钟 而再过半分钟就能在细胞内测到相应的蛋白质 07 01 2020 16 3 2转录机器的主要成分 1 RNA聚合酶RNA聚合酶是转录过程中最关键的酶 主要以双链DNA为模板 以4种核苷三磷酸作为活性前体 并以Mg2 Mn2 为辅助因子 催化RNA链的起始 延伸和终止 它不需要任何引物 催化生成的产物是与DNA模板链相互补的RNA 07 01 2020 17 Capableofpolymerizationbutnotinitiation 1 RNApolymerasecoreenzyme 07 01 2020 18 Coreenzyme sigmafactorThesigmafactorisaseparateproteinrequiredforinitiationTherearemanydifferentsigmafactorsDifferentsigmafactorsallowfortheexpressionofdifferentgenes 2 RNApolymeraseholoenzyme 07 01 2020 19 3 各个亚基的功能 07 01 2020 20 因子能识别并与启动子区的特异性序列相结合 07 01 2020 21 Thefivesubunitsofthebacterialenzymearedistinguishedbycolor OnlytheN terminaldomainsofthealphasubunitsareincludedinthismodel 07 01 2020 22 核心酶 CoreEnzyme 作用于转录的延伸过程 终止 依靠静电引力与DNA模板结合 蛋白质中碱性基团与DNA的磷酸根之间 非专一性的结合 与DNA的序列无关 结合常数 1011 mol 07 01 2020 23 全酶 HoloEnzyme 用于转录的起始 依靠空间结构与DNA模板结合 与核心酶结合后引起的构象变化 专一性地与DNA序列 启动子 结合 结合常数 1014 mol 半衰期 数小时 转录效率低 速度缓慢 的结合 07 01 2020 24 此外 新发现的一种 亚基的功能尚不清楚 2 各亚基的特点和功能 1 因子 sigmafactor 因子可重复使用 修饰RNApol构型 使HoloEnzyme识别启动子的 35区 并通过 与模板链结合 2 2 2 2 3 全酶的组装过程 07 01 2020 25 因子的作用是负责模板链的选择和转录的起始 它是酶的别构效应物 使酶专一性识别模板上的启动子 核心酶在T7噬菌体DNA上约有1300个结合位点 平均结合常数为2 1011 因子可以极大地提高RNA聚合酶对启动子区DNA序列的亲和力 酶底结合常数提高103倍 酶底复合物的半衰期可达数小时甚至数十小时 因子还能使RNA聚合酶与模板DNA上非特异性位点的结合常数降低104倍 使酶底复合物的半衰期小于1秒 07 01 2020 26 大肠杆菌中的 因子能识别并与启动子区的特异性序列相结合 07 01 2020 27 不同的 因子识别不同的启动子E coli中有四种 因子 70 32 54 28 枯草杆菌中有6种 因子 因子的更替对转录起始的调控 2 因子 核心酶的组建因子 促使RNA聚合酶与DNA模板链结合酶 前端 因子 使模板DNA双链解链为单链 尾端 因子 使解链的单链DNA重新聚合为双链 07 01 2020 28 3 因子 完成核苷酸底物之间的磷酸酯键的连接 Editing功能 排斥与模板链不互补的碱基 与Rho 因子竞争RNA3 end 促进RNA聚合酶 NTPRNAelongation 07 01 2020 29 4 因子 参与RNA非模板链 sensestrand 的结合 充当SSB 07 01 2020 30 由于各亚基的功能 使全酶本身含有五个功能位点 有义DNA链结合位点 亚基提供 DNA RNA杂交链结合位点 亚基提供 双链DNA解链位点 前端 亚基提供 单链DNA重旋位点 后端 亚基提供 因子作用位点 07 01 2020 31 CoreEnzyme具有的四个功能位点 DNA RNA杂交位点 D S DNA解链位点 D S DNA重旋 启动子识别位点 DNA有义链结合位点 07 01 2020 32 Noproofreadingnucleaseactivities1errorin105bpAbout105lowerthanreplication Thefidelity 保真性 ofRNApolymerase 07 01 2020 33 真核生物中的RNA聚合酶 真核生物中有3类RNA聚合酶 其结构比大肠杆菌RNA聚合酶复杂 它们在细胞核中的位置不同 负责转录的基因不同 对 鹅膏覃碱的敏感性也不同 真核生物RNA聚合酶一般有8 14个亚基所组成 相对分子质量超过5 105 07 01 2020 34 真核生物RNA聚合酶的主要特征 聚合酶中有两个相对分子质量超过1 105的大亚基 同种生物3类聚合酶有 共享 小亚基的倾向 即有几个小亚基是其中3类或2类聚合酶所共有的 07 01 2020 35 真核细胞中三类RNA聚合酶特性比较 07 01 2020 36 2020 1 7 37 TenofthetwelvesubunitsconstitutingyeastRNApolymeraseIIareshowninthismodel Subunitsthataresimilarinconformationtothoseinthebacterialenzymeareshowninthesamecolors TheC terminaldomainofthelargesubunitRPB1wasnotobservedinthecrystalstructure butitisknowntoextendfromthepositionmarkedwitharedarrow 07 01 2020 38 07 01 2020 39 Allthreeyeastpolymeraseshavefivecoresubunitshomologous thetwo and subunitsofE coliRNApolymerase Thelargestsubunit RPB1 ofRNApolymeraseIIalsocontainsanessentialC terminaldomain CTD RNApolymerasesIandIIIcontainthesametwononidentical likesubunits whereasRNApolymeraseIIcontainstwoothernonidentical likesubunits Allthreepolymerasessharethesame likesubunitandfourothercommonsubunits Inaddition eachyeastpolymerasecontainsthreetosevenuniquesmallersubunits 07 01 2020 40 2 转录复合物 启动子选择阶段包括RNA聚合酶全酶对启动子的识别 聚合酶与启动子可逆性结合形成封闭复合物 closedcomplex 此时 DNA仍处于双链状态 然后 封闭复合物转变成开放复合物 opencomplex 聚合酶全酶所结合的DNA序列中有一小段双链被解开 对于强启动子来说 从封闭复合物到开放复合物的转变是不可逆的 是快反应 07 01 2020 41 开放复合物与最初的两个NTP相结合并在这两个核苷酸之间形成磷酸二酯键后即转变成包括RNA聚合酶 DNA和新生RNA的三元复合物 除RNA聚合酶之外 真核生物转录起始过程中至少还需要7种辅助因子参与 07 01 2020 42 一般情况下 转录起始复合物可以进入两条不同的反应途径 合成并释放2 9个核苷酸的短RNA转录物 即所谓的流产式起始 尽快释放 亚基 转录起始复合物通过上游启动子区并生成由核心酶 DNA和新生RNA所组成的转录延伸复合物 07 01 2020 43 转录延伸复合物较为稳定 可长时间与DNA模板结合而不解离 只有在遇到转录终止信号时 RNA聚合酶才停止加入新的核苷酸 RNA DNA杂合物解离 释放转录产物并导致聚合酶本身从模板DNA上脱落 07 01 2020 44 3 3启动子与转录的起始 启动子 promoter 是指DNA分子上被RNA聚合酶识别并结合形成起始转录复合物的区域 它还包括一些调节蛋白因子的结合位点 07 01 2020 45 3 3 1原核生物的启动子 I 转录起始点转录起始点在多数情况下为嘌呤 90 常见的序列为CAT A为转录的起始点 07 01 2020 46 II 10序列 PribonowBox 10序列 RNA聚合酶的牢固结合位点 结合位点 B位点 一致序列 T80A95T45A60A50T96 因此又称TATABox位置范围 18bp到 9bp TATA区 酶的紧密结合位点 富含AT碱基 利于双链打开 07 01 2020 47 III 35序列 SextamaBox 35序列 RNA聚合酶的松弛 初始 结合位点RNA聚合酶依靠其 亚基识别该位点大多数启动子中共有序列为T82T84G78A65C54A45重要性 很大程度上决定了启动子的强度位置在不同启动子中略有变动 TTGACA区 提供了RNA聚合酶全酶识别的信号 07 01 2020 48 IV 10区和 35区间距离在90 的原核生物中为16到18bp适宜的距离能为RNA聚合酶提供合适的空间结构 便于转录的起始 典型的原核生物的启动子结构为 35 16 19bp的间隔区 10区和转录起始点 10区到转录起始点的距离为7bp 07 01 2020 49 大肠杆菌RNA聚合酶全酶所识别的启动子区 07 01 2020 50 RNApolymerasescansDNAlinearlySlidesalongDNAwithoutopeningstrandsDetectssequencesof 10and 35inthemajorgrooveSigmafactorallowsRNApolymerasetobindtopromoter 3 3 2原核生物转录的起始 07 01 2020 51 A 全酶与启动子结合的封闭型启动子复合物的形成 R位点被 因子发现并结合 开放型启动子复合物的形成RNApol的一个适合位点到达 10序列区域 诱导富含A T的Pribnow框的 熔解 形成12 17bp的泡状物 同时酶分子向 10序列转移并与之牢固结合开放型启动子复合物使RNA聚合酶定向两种复合物均为二元复合物 全酶和DNA 07 01 2020 52 c 在开放型的启动子复合物中 RNApol的I位点和E位点的核苷酸前体间形成第一个磷酸二酯键 亚基 三元复合物形成 1位多为CAT模式 位于离开保守T6 9个核苷酸处 4 因子解离 核心酶与DNA的亲和力下降起始过程结束 核心酶移动进入延伸过程 07 01 2020 53 转录的起始过程 核心酶 12 17bp 07 01 2020 54 07 01 2020 55 启动子各位点与转录效率的关系 1 35序列与 10序列与转录效率的关系标准启动子 35TTGACA 10TATAAT 07 01 2020 56 不同的启动子的区别 a 与标准启动子序列同源性越高 启动强度越大b 与标准启动子同源性越低 启动强度越小c 与标准启动子差异很大时 由另一种 因子启动 原因 35序列通过被 因子识别的容易程度 决定启动子强度 10序列影响开放型启动子复合物形成的速度 决定启动子强度 07 01 2020 57 2 35序列与 10序列的间隔区与转录效率的关系 碱基序列并不重要 间距非常重要 17bp的间距转录效率最高 间距上的突变种类 间距趋向于17bp 上升突变间距远离17bp 下降突变 07 01 2020 58 1 RNA聚合酶 的启动子 结构最复杂 位于转录起始点的上游 有多个短序列元件组成 通用型启动子 无组织特异性 1 TATA框 Hogness框或Goldberg Hogness框 位于 25 30处一致序列为T82A97T93A85A63 T37 A83A50 T37 定位转录起始点的功能 类似原核生物的 10序列的Pribnow框TATA框是绝大多数真核基因的正确表达所必需的 3 3 3真核生物的启动子 07 01 2020 59 2 CAAT框 CAATbox 位于 70 80区处 一致序列为GGC TCAATCT 前两个G的作用十分重要 转录效率 增强启动子的效率 频率 不影响启动子的特异性 3 GC框 GCbox 在 80 110区 含有GCCACACCC或GGGCGGG序列 4 帽子位点转录起始位点 碱基大多为A以上三个保守序列在绝大多数启动子中都存在 07 01 2020 60 RNA聚合酶 的启动子结构 07 01 2020 61 5 增强子 enhancer 能强化转录起始的序列为增强子或强化子 又称远上游序列 farupstreamsequence 它是远距离调节启动子以增加转录速率的DNA序列 其增强作用与序列的方向无关 与它在基因的上下游位置无关 增强子有强烈的细胞类型选择 即不同细胞类型 增强作用不同 07 01 2020 62 BindingofActivatorFactors Finally high leveltranscriptionisinducedbythebindingofactivatorfactorstoDNAseq