血红蛋白的提取和分离shkPPT课件.ppt

血红蛋白的提取和分离 1 学习目标 简述蛋白质提取和分离的基本原理 并了解凝胶色谱法 电泳法等分离生物大分子的基本原理 1 主要概念 凝胶色谱法 电泳法 缓冲溶液 它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用 2 主要原理 凝胶色谱法分离蛋白质的原理 电泳法分离样品的原理 缓冲溶液的组成和作用机理3 课题重点 凝胶色谱法的原理和方法4 课题难点 样品的预处理 色谱柱填料的处理和色谱柱的装填 2 2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成这标志着进入了后基因组和蛋白质组时代 人类基因组 指DNA分子所携带的全部遗传信息 蛋白质组 生物个体表达的蛋白质分子的总和 主要是对蛋白质功能的研究 对蛋白质的研究和应用 首先需要获得纯度较高的蛋白质 如何从复杂的细胞混合物中提取 分离高纯度的蛋白质呢 3 思考1分离生物大分子的基本思路是什么 选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子 思考2蛋白质的分离和提取的原理是什么 根据蛋白质各种特性的差异 如分子的形状和大小 所带电荷的性质和多少 溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等 可以用来分离不同蛋白质 你认为分离蛋白质和分离DNA一样容易吗 4 思考3人们用鸡的红细胞提取DNA 用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么 鸡的红细胞具有细胞核 含有DNA 便于进行DNA的提取 人的红细胞无细胞核 结构简单 血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白 5 分离蛋白质的方法 6 一 基础知识 凝胶色谱法 分配色谱法 1 凝胶 一些微小多孔的球体 内含许多贯穿的通道 由多糖类化合物构成如葡聚糖 琼脂糖 具多孔的凝胶就叫分子筛 2 概念 根据被分离的蛋白质相对分子质量的大小 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用 来进行分离 7 3 原理 当不同的蛋白质通过凝胶时 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道 路程 移动速度 而 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道 只能在 移动 路程 移动速度 相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离 4 具体过程 相对分子质量较小 较长 较慢 相对分子质量较大 凝胶外部 较短 较快 8 9 10 1 概念 在一定的范围内 能对抗外来少量强酸 强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用 具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液 缓冲溶液 2 作用 能够抵制 对溶液的 的影响 维持PH基本不变 外界的酸或碱 PH值 11 3 缓冲溶液的配制 通常由 种缓冲剂溶解于水中配制而成 调节缓冲剂的 就可以制得 使用的缓冲液 1 2 使用比例 在不同PH范围内 思考 说出人体血液中缓冲对 NaH2PO4 Na2HPO4 H2CO3 NaHCO3 12 电泳 1 概念 指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程 思考 在整个实验过程中使用的缓冲液是什么 它的目的是什么 使用的是磷酸缓冲液 目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境 保证血红蛋白的正常结构和功能 便于观察 红色 和材料的科学研究 活性 13 2 原理 许多重要的生物大分子 如 等都具有 在 下 这些基团会带上 在电场的作用下 这些带电分子会向着与其 移动 电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身 的不同使带电分子产生不同的 从而实现样品中各种分子的分离 多肽 核酸 可解离的基团 正电或负电 所带电荷相反的电极 带电性质的差异 大小 形状 迁移速度 一定的PH 14 15 1 聚丙稀酰胺凝胶 是由单体丙烯酰胺和交联剂N N 甲叉双丙烯酰胺在引发剂 过硫酸铵和催化剂 四甲基已二胺 的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶 3 分类 两种常用的电泳方法 琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素 2 原理 16 为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入 SDS能使蛋白质发生完全变性 由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链 因此测定的结果只是 SDS能与各种蛋白质形成蛋白质 SDS复合物 SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量 因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别 使电泳迁移率完全取决于 3 SDS 聚丙稀酰胺凝胶电泳作用机理 单条肽链的分子量 分子的大小 SDS 注意 测定 通常用十二烷基磺酸钠 SDS 聚丙稀酰胺凝胶电泳 蛋白质相对分子质量 17 聚丙烯酰胺凝胶电泳对分离大分子具有较高的分辨率 但核酸比蛋白质分子大得多 只能采用较大孔径的琼脂糖凝胶电泳 核酸分子本身含有大量的磷酸根 核酸带负电荷 在电场中向正极移动 溴化乙啶荧光染料对核酸染色在紫外线的照射下 发出橙红色荧光 根据荧光条带的粗细和分布的位置 可以用在对PCR扩增效果的鉴定上 说明 18 电泳检测PCR结果 19 二 实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步 1 样品处理 包括洗涤红细胞 血红蛋白稀释 离心等操作收集到血红蛋白溶液 2 粗分离 透析除去分子较小的杂质 3 纯化 通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去 4 纯度鉴定 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定 F 生物技术实践视频 高中生物选修1实验电影血红蛋白的提取和分离 flv 20 二实验操作 1 样品处理和粗分离 血液 血浆 水分 其他物质 血浆蛋白 无机盐磷脂葡萄糖等 血细胞 白细胞 血小板 红细胞 最多 血红蛋白 两个a 肽链 两个 一肽链 共四条肽链 90 21 22 23 每个肽链环绕一个亚铁血红素基团 此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳 血红蛋白因含有血红素而呈红色 24 目的 去除 方法 离心 速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果 然后用胶头吸管吸出上层透明的 将下层 的红细胞液体倒入 每个肽链环绕 此基团可携带 血红蛋白因含有 而呈红色 本课题可选用猪 牛 羊或其他哺乳动物的血液来分离血红蛋白 一个亚铁血红素基团 一分子氧或一分子二氧化碳 血红素 1 红细胞的洗涤 杂质蛋白 低速短时间 黄色血浆 暗红色 烧杯 25 再加入用 的 质量分数为0 9 的氯化钠溶液洗涤 缓慢搅拌10min 离心 五倍体积 生理盐水 低速短时间 如此重复洗涤 次 直至上清液中已没有 表明洗涤干净 利于后续血红蛋白的分离纯化 不可洗涤次数过少 三 黄色 26 洗涤过程图解 血液100mL 重复洗涤3次 直至上清液没有黄色 27 2 血红蛋白的释放 加 到 体积 再加40 体积的 溶解细胞膜 置于 上充分搅拌10min 加速细胞破裂 细胞破裂释放出血红蛋白 3 分离血红蛋白溶液将搅拌好的混合液转移到离心管内 以2000r min的速度离心10min 试管中的溶液分为4层 原血液 甲苯 磁力搅拌器 蒸馏水 28 第1层 最上层 甲苯层 第2层 中上层 色薄层固体 的沉淀层 第3层 中下层 的液体 的水溶液层 第4层 最下层 其它杂质 的沉淀层 无色透明 脂溶性物质 白 血红蛋白 红色透明 暗红色 29 用过滤 除去 于分液漏斗中静置片刻后 分出下层的红色透明液体 滤纸 脂溶性沉淀层 30 分离血红蛋白 分离过程 红细胞混合液 31 取 ml的血红蛋白溶液装入 中 将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol L的 中 pH为 透析12小时 目的是 或用于更换样品中的 透析袋一般用硝酸纤维素制成 又称玻璃纸 除去样品中分子量较小的杂质 透析袋 磷酸缓冲液 7 0 缓冲液 4 透析 粗分离 1 32 33 2020 1 8 34 小结 样品处理和粗分离 1 红细胞的洗涤 目的是去除杂蛋白 要加入柠檬酸钠防止血液凝固 离心将血液分层 用胶头吸管吸出黄色血浆 用生理盐水洗涤 2 血红蛋白的释放 在蒸馏水和甲苯作用下 红细胞破裂释放3 分离血红蛋白溶液 离心分层 滤纸过滤去除脂溶性沉淀层 分液漏斗分出红色透明液体 4 透析 装入透析袋并置于磷酸缓冲液中 PH为7 0 透析 去除小分子杂质 35 2 凝胶色谱操作 1 凝胶色谱柱的制作 2 凝胶色谱柱的装填 3 样品的加入和洗脱 血红蛋白的纯化 36 凝胶色谱柱的制作 注意事项 底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面 否则难以铺实尼龙网 还会导致液体残留 蛋白质分离不彻底 材料 交联葡聚糖凝胶G 75 20mmol L磷酸缓冲液装填 2 凝胶色谱柱的装填 立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h 洗涤平衡 一次性缓慢倒入 轻轻敲打 装填悬浮液 凝胶颗粒 洗脱液 沸水浴 凝胶颗粒 蒸馏水 充分溶胀 根据色谱柱体积计算凝胶用量 色谱柱垂直固定在支架上 配制悬浮液 计算称量凝胶 固定色谱柱 38 3 样品的加入和洗脱 调节缓冲液面 滴加透析样品注意 正确的加样操作是 1 不要触及并破坏凝胶面 2 贴壁加样 3 使吸管管口沿管壁环绕移动 样品渗入凝胶床 洗脱 收集注意 在分离过程中 如果红色区带均匀一致的移动 说明色谱柱制作成功 39 40 3 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 选做 判断 的蛋白质是否达到要求 需要进行蛋白质的鉴定 纯化 41 知识总结 血红蛋白的提取和分离 42 影响蛋白质分子运动的因素 43 观察你处理的血液样品离心后是否分层 见教科书图5 18 如果分层不明显 可能是洗涤次数少 未能除去血浆蛋白的原因 此外 离心速度过高和时间过长 会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀 也得不到纯净的红细胞 影响后续血红蛋白的提取纯度 三实验结果分析与评价 1 是否完成对血液样品的处理 44 由于凝胶是一种半透明的介质 因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯 检查凝胶是否装填得均匀 此外 还可以加入大分子的有色物质 例如蓝色葡聚糖 2000或红色葡聚糖 观察色带移动的情况 如果色带均匀 狭窄 平整 说明凝胶色谱柱的性能良好 如果色谱柱出现纹路或是气泡 轻轻敲打柱体以消除气泡 消除不了时要重新装柱 2 凝胶色谱柱的装填是否成功 45 3 血红蛋白的分离是否成功 如果凝胶色谱柱装填得很成功 分离操作也正确的话 能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀 狭窄 平整 随着洗脱液缓慢流出 如果红色区带歪曲 散乱 变宽 说明分离的效果不好 这与凝胶色谱柱的装填有关 46 课后练习 1 提取DNA的第一步是材料的选取 其目的是一定要选取DNA含量较高的生物材料 否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难 第二步是DNA的释放和溶解 这一步是实验成功与否的关键 要尽可能使细胞内的DNA全部溶解 第三步是DNA的纯化 即根据DNA的溶解特性 对酶及高温的耐受性的不同等特性 最大限度地将DNA与杂质分开 最后一步是对DNA进行鉴定 这是对整个实验的结果的检测 P57 47 2 提取蛋白质比提取DNA的难度大 这是因为 与DNA相比 蛋白质对温度 盐浓度 pH等条件要敏感得多 很容易失活 并且蛋白质的空间结构多种多样 理化性质各不相同 使得蛋白质的提取没有一种统一的方法 只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件 设计特定的方法 48 课后练习 P63 1 绘图可参考教科书中图5 9 PCR反应中的目的片段一般以2n的方式积累 其中n为反应循环次数 一个DNA片段在30次循环后反应物中大约有10亿个这样的片段 2n 230 1073741824 2 PCR引物是根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计的 49 课后练习 P70 1 凝胶色谱法也称为分配色谱法 它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一 所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体 这些小球体大多数是由多糖类化合物构成 小球体内部有许多贯穿的通道 当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时 各分子在色谱柱内进行两种不同的运动 即垂直向下的运动和无规则的扩散运动 相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部 只能分布在颗粒之间 通过的路程较短 移动速度较快 相对分子质量较小的蛋白质分子比较 50 容易进入凝胶内的通道 通过的路程较长 移动速度较慢 因此 样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出 相对分子质量中等的分子后流出 相对分子质量最小的分子最后流出 这种现象又叫分子筛现象 此外 凝胶本身具有三维网状结构 相对分子质量大的分子通过这种网状结构上的空隙时阻力大 而相对分子质量小的分子通过时阻力小 因此不同分子量的蛋白质分子可以获得分离 51 2 在一定范围内 能对抗外来少量强酸 强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用 具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液 缓冲溶液通常是由一或两种化合物 缓冲剂 溶解于水中制得 调节缓冲剂的配比就可制得不同pH范围的缓冲液 缓冲溶液的作用是维持反应体系的pH不变 在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH下进行的 受到氢离子浓度的严格调控 为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境 就必须保持体外生物化学反应过程有与体内过程完全相同的pH 52 3 电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 许多重要的生物分子 如氨基酸 多肽 蛋白质 核苷酸 核酸等都具有可解离基团 它们在某个特定的pH下会带上正电或负电 在电场的作用下 这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动 电泳技术就是在电场的作用下 利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小 形状等性质的差异 使带电分子产生不同的迁移速度 从而达到对样品进行分离 鉴定或提纯的目的 53 4 血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步 包括 样品处理 粗分离 纯化和纯度鉴定 首先通过洗涤红细胞 血红蛋白的释放 离心等操作收集到血红蛋白溶液 即样品的处理 再经过透析去除分子量较小的杂质 即样品的粗分离 然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去 即样品的纯化 最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定 54 5 血红蛋白是有色蛋白 因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液 这使血红蛋白的分离过程非常直观 大大简化了实验操作 55 讨论 如何测定蛋白质的分子量 使用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时 可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳 根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置 用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线 可以测定未知蛋白质的分子量 市场上有高分子量 次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售 56 练习巩固 1 随着人类跨入蛋白质组时代 对蛋白质的研究和应用越来越深入 首先要做的一步是A弄清各种蛋白质的空间结构B弄清各种蛋白质的功能C弄清各种蛋白质的合成过程D获得高纯度的蛋白质 57 2 用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中 关于蛋白质的叙述 正确的是A相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质B相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质C相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质D二者根本无法比较 58 3 使用SDS 聚丙烯酰胺电泳过程中 不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A电荷的多少B分子的大小C肽链的多少D分子形状的差异4 在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是A调节pHB维持红细胞的能量供应C防止微生物生长D防止血液凝固 59 5 一分子血红蛋白最多可携带的O2分子数和CO2分子数分别是A4 2B4 4C2 1D 1 16 记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序自上而下是 有机溶剂 脂类物质 血红蛋白溶液 红细胞破碎物沉淀 60 7 相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个 B 61 8 凝胶色谱柱取长为40cm 内径为1 6cm 有关说法中 正确的是 多选 A 一般凝胶色谱柱直径的大小不影响分离的效果B 凝胶色谱柱过高超过1m 不影响分离