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基因工程实验流程总览 DNA提取 纯化 限制图谱 琼脂糖电泳检测片段 体外扩增PCR 目的基因制备 载体选择 DNA重组片段连接 未知核酸序列须 DNA片段大小估计 互补性黏性不互补性黏性末端平末端 限制性核酸内切酶酶切分离法简单基因组分离如质粒和病毒 物理化学法 构建基因组文库 PCR扩增 基因的化学合成 双抗体免疫法 酶促反应mRNA cDNA 目的基因分离 双酶切部分酶切Bal31逐步切割 转座子基因定位克隆酵母双杂交 前处理防止自连 RNA提取 RT PCR TA克隆 蓝白选择 胶回收 表达引物PCR 载体 PCR产物回收 转化感受态细胞 构建基因组文库 真核生物有成千上万个碱基对 单个未知基因在整个基因组中的比例很小且不能在体外特异性扩增 所以只能对所有基因扩增 也就是构建基因组文库 油菜TOC33基因片的克隆 实验项目背景国家自然科学基金项目 油菜叶绿体蛋白质转运突变体中差异表达基因的克隆 编号 30170500 实验目的通过本综合实验 掌握植物基因组DNA的制备技术 PCR技术 限制性内切酶酶切技术 重组DNA技术 克隆鉴定技术 质粒DNA的制备 琼脂糖凝胶电泳技术 测序技术 生物信息技术等 得到一个与科学研究过程相近的分子生物学综合技能训练 具体实验步骤 植物基因组DNA的制备 TOC33基因片段的PCR扩增 DNA的琼脂糖凝胶上回收与纯化IV DNA片段的体外重组与转化V 克隆的筛选与鉴定VI 序列分析 植物基因组DNA的制备 取0 2g样品嫩叶至1 5mLEP管中 放在液氮中冷冻处理后 在EP管中充分捣碎 加入0 6mL抽提缓冲液 65 水浴处理10min 12 000rpm离心3min 取上清 加入二倍体积预冷的无水乙醇沉淀 遇有絮状沉淀 4 000rpm离心5min 沉淀用50ulTE RNase 5 0mMTris HClpH8 0 1 0mMEDTApH8 0 RNaseA30ug mL 溶解 37 保温处理15min 加入二倍体积预冷的无水乙醇 20 下沉淀10min 4 000rpm离心3min 加适量70 乙醇洗沉淀 自然干燥或37 烘干 加入50ulddH2O溶解备用 TOC33基因片段的PCR扩增 引物设计 为扩增Toc33片段 用OLIG05 0设计1对PCR引物 上游引物P1 5 一ATGGGGTCTCTCGTTCGTGAAT 3 下游引物P2 5 一TTAAAGTGGCTTTCCACTTGTC一3 在0 2mLEppendorf管内配制25ul反应体系 10 PCRBuffer2 5ulMg2 1 5uldNTP1 0ulPrimer11 0ulPrimer21 0ulTaq酶0 5ul模板1 0ulddH2O16 5ul 1 94oC预变性5min2 94oC变性30sec3 55oC退火30sec4 72oC延伸45sec5 重复步骤2 4 30次6 72oC延伸10min 琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果1 称取0 5g琼脂糖放入溶胶瓶中 再加入1ml50 TAE缓冲液 49ml高水 置微波炉或水浴加热至完全融化 取出摇匀 则为1 琼脂糖凝胶液 2 取电泳槽里面的胶板 用胶带将两端封好 调平 并放好样品梳子 3 将冷到60oC左右的琼脂糖凝胶液 缓缓倒入胶板 直至胶板上形成一层均匀的胶面 4 待胶凝固后 取出梳子 放在电泳槽内 电泳槽内应加入电泳缓冲液 5 用移液枪将已加入上样缓冲液的PCR产物加入加样孔 6 接通电泳槽和电泳仪的电源 注意正负极 DNA片段从负极向正极移动 选择合适的电压 开始电泳 7 当溴酚蓝燃料移动倒距离凝胶前言1 2cm处 停止电泳 8 将电泳的凝胶浸入溴化乙锭染色液中 染色10min后取出 用清水冲洗 将胶放于凝胶成像系统内拍照 以观察样品在琼脂糖凝胶中的带 EB有剧毒 戴手套操作 电泳染色后 在紫外分析仪上切取所需要的条带 按1克胶 1000添加提取缓冲液 放在60度的金属浴中溶解 然后把溶液转移到试剂盒专用管中 6000转 分离心1分钟 倒掉上清 再加入500微升的extractionbuffer 12000r min离心1分钟 倒掉上清 加入750微升的washbuffer 12000r min离心1分钟 倒掉上清 重复步骤三 倒掉上清 在12000r min下空转1分钟 把带有膜的管子换到新的EP管中 加入30 50微升的水 静置1分钟 12000r min离心一分钟 即得到所要回收的片断 此样品可用来做酶切等 琼脂糖凝胶上DNA的回收与纯化 IV DNA片段的体外重组加试剂顺序由上到下 用500ul的EP管装 加完之后混匀 短时离心 用封口胶封口 将EP管放入金属浴当中37度酶切两个半小时左右 取出酶切产物 用试剂盒进行割胶回收进一步纯化酶切片断以进行连接反应 酶切体系 40 0ulddH2O9 0ul10 Buffer4 0ulDNA25 0ulXbaI 1 0ulHindIII1 0ul 连接反应 连接体系 20 0ul 酶切产物3 0ulBuffer1 0ul载体14 0ulLiagse2 0ul 加试剂顺序由上到下 用500ul的EP管装 加完之后混匀 短时离心 用封口胶封口 将EP管放入金属浴当中16度连接过夜 IV DNA片段的转化1 从液氮中取出感受态细胞 完全融化后 用移液枪将连接产物加入感受态细胞中 温柔混匀 在冰上放置半个小时 2 42OC热激90sec 再在冰上放10min 然后导入SOC 1 5mlEP管 中 在37OC摇床上200rpm进行振荡一小时 3 在这段时间里可以准备平板 25ml左右加了抗生素的60度左右的LB固体培养基倒入事先灭菌的培养皿中 在表面涂布上X gal和ITPG 4 取出摇得菌液在离心机上6000转每分钟离心五分钟 然后将大部分培养基倒出 剩余大概五十微升左右的SOC即可 注意不可将沉淀倒出 5 用移液枪将沉淀吹散均匀 将其加入事先倒好的平板上 加入涂布玻璃珠进行涂布 涂布均匀后将平板倒置放于37OC培养箱内过夜培养 第二天从转化的平板上挑去白色的菌落以验证是否是阳性克隆 V 克隆的筛选与鉴定1 用移液枪在1 5mlEP管中加入液体LB培养基500ul 再用灭过菌的牙签在生长蓝白斑的平板上挑取阳性克隆放于EP管中 丢弃牙签 盖紧管口 用报纸包好放到37OC 200r min的摇床中过夜培养 2 EP管出现混浊 用质粒提取试剂盒提取质粒 3 对于得到的质粒再酶切电泳检测阳性克隆 如果酶切后的电泳图上出现了与插入片断相应大小的条带 证明是此单菌落是阳性克隆 否则是假阳性的 试剂盒质粒回收过程 把过夜培养菌液 10000r min离心1分钟 倒掉上清液 向菌体中加入质粒回收试剂盒中的SolutionI400微升 震荡 直到沉淀的菌体完全悬浮 然后加入400微升的SolutionII 轻轻地颠倒混匀 然后在室温下放置2分钟 加入525微升的SolutionIII 颠倒混匀 直到出现白色的絮状沉淀 10000r min离心10分钟 把上清液转移到试剂盒专用管中 10000r min离心1分钟 倒掉溶液 向管子中加入600微升的bufferHB 10000r min离心1分钟 倒掉溶液 加入750微升的washbuffer 10000r min离心1分钟 重复上一步骤7次 倒掉溶液后空转一次 以尽量除尽残余的washbuffer 将带有膜的管子转移到新的EP管中 加入100微升的水 静置1分钟 10000r min离心1分钟 即得到所需要的质粒 VI 序列分析 获得的阳性单克隆送样测序 测序结果的同源性比较采用GenBank中的BLAST分析程序 基因序列比较运用DNAsist软件 实验起始材料的选取和准备mRNA的提取 纯化目标片段的克隆和分析DNA RNA的提取 纯化和分析克隆化基因的表达及表达蛋白的纯化和功能分析基因转化实验及转基因结果分析 一 实验起始材料的选取和准备 水稻卵细胞的分离 分离准备工作 材料的速冻 长期保存 人工气候箱 制冰机 超净工作台 显微操作系统 RNase free耗材 液氮罐 超低温冰箱 RNase抑制剂 二 卵细胞mRNA的提取 纯化 Oligotex系列试剂盒 细胞裂解 匀浆 去蛋白和细胞残渣 温浴并结合 洗脱 去盐和回收 旋涡混匀器 离心机 恒温水浴锅 离心机 旋涡混匀器 200 烘箱 DEPC RNase freeDNaseI RNase free耗材 三 目标片段的克隆和分析 利用SMARTcDNA文库构建试剂盒构建水稻卵细胞cDNA文库 目标基因的获得 通过噬菌体载体自切割或T Vector 平末端载体克隆获得目标质粒 利用测序仪和通用引物对克隆的目的基因测序 1 通过SMART技术构建cDNA文库 第一链的合成 第二链的合成和扩增 酶切 纯化和片段分离 cDNA检测 插入载体并包装 文库质量检测 文库扩增及保藏 恒温水浴锅 制冰机 RTase RNase抑制剂 PCR仪 高保真Taq酶 恒温水浴锅 离心机 限制性内切酶 过滤柱 电泳仪器 凝胶成像系统 琼脂糖 恒温水浴锅 超净工作台 烘箱 PCR仪 培养基 超低温冰箱 DMSO 2 目标基因的克隆 利用特异探针 通过核酸杂交的方法或利用特异的抗体 通过抗原 抗体反应进行文库目标基因的筛选将培养于平板的噬菌斑通过印迹转于尼龙膜 并于核酸交联仪中固定 在杂交箱中利用特定探针杂交 最后在恒温摇床中洗膜 探针标记 放射性和非放射性 将噬菌体培养于平板 于42 培养几小时后 于37 用IPTG诱导融合蛋白的表达并印记于尼龙膜上 利用抗原 抗体反应进行杂交利用GSP 基因特异引物 通过PCR扩增出目标基因利用GSP 以文库为模板通过PCR扩增出目标基因 并通过电泳 凝胶成像系统检测 利用文库载体序列和已知的目标基因的序列设计通用引物和GSP 通过5 RACE和3 RACE扩增出目标基因的5 和3 端序列 并通过电泳 凝胶成像系统检测 通过5 RACE和3 RACE克隆已知部分序列的目标基因 四 DNA RNA的提取 纯化和分析 包含有目标基因的质粒的获得对于通过筛库技术获得的目标基因 通过噬菌体载体的自切割作用生成目标质粒 水稻基因组DNA的提取 纯化和分析水稻各器官TotalRNA的提取 纯化和分析 质粒提取 分析 常规质粒提取方法 通过细菌的适当裂解释放出质粒 利用酚和氯仿抽提掉蛋白 再利用无水乙醇沉淀质粒DNA质粒提取试剂盒 裂解方法一致 裂解完成后利用过滤柱纯化出质粒DNA质粒提取后 根据以后实验要求利用不同的限制性内切酶在水浴锅中进行酶切电泳 用凝胶成像系统分析测序 水稻基因组DNA的提取 纯化和分析 利用SDS法或Qiagen提供的基因组提取试剂盒提取水稻基因组DNA 利用SDS在高钾离子浓度的情况下能沉淀蛋白和多糖等杂质的原理提取基因组DNA利用酚 氯仿抽提或过滤柱纯化基因组DNA水稻基因组文库的构建利用特异的探针 通过Southernblotting检测目标基因的拷贝数 水稻各器官TotalRNA的提取 纯化和分析 分离所需的水稻各器官组织 并利用Qiagen的RNeasy系列试剂盒提取总RNA 将材料裂解后 通过过滤柱纯化出总RNA在RNase free的情况下 通过甲醛变性胶电泳检测总RNA的质量利用特异性的探针 通过Northernblotting检测目标基因在各器官的表达情况 Southernblotting 基因组DNA完全消化 探针制备 琼脂水平电泳 比活性测定 印迹转膜 DNA交联 限制性内切酶 恒温水浴锅 手提紫外灯 电泳仪器 真空转膜仪 紫外交联仪 同位素检测仪 探针制备试剂盒 尼龙膜 制备好的尼龙膜 探针 放射性或非放射性 杂交 杂交箱 放射自显影 荧光 同位素检测仪磷屏成像系统 荧光扫描成像系统 克隆化基因的表达及表达蛋白的纯化和功能分析 克隆化基因的表达表达蛋白的纯化功能分析 克隆化基因的表达 基因的克隆 利用高保真的Taq酶和合适的反应系统 通过PCR获得与目标基因完全一致的DNA片段 通过测序确证 体内表达 选择合适的表达载体插入目标片段 利用化学方法或电转化仪等手段转入细胞表达体外转录和翻译系统 兔网织红细胞裂解物 小麦胚芽提取物等 表达蛋白的纯化 SDS聚丙烯酰胺胶回收 利用SDS聚丙烯酰胺胶分离不同大小的的蛋白 利用6 HIS GST 谷胱甘肽 等和亲和树脂纯化 通过表达目标基因的融合蛋白 利用亲和层析洗脱出目标蛋白自动核酸 蛋白纯化工作站 目标蛋白功能分析 抗体的制备 多抗 单抗DNA 蛋白质相互作用研究 Gel shift实验 蛋白质磷酸化分析 酵母单杂交系统等蛋白质 蛋白质相互作用研究 酵母双杂交系统 噬菌体表面展示技术等 蛋白体内表达研究 Westernblotting 利用抗原 抗体反应 对蛋白质混合物中的目标蛋白进行鉴别和定量免疫组织化学研究 通过切片技术和免疫反应 利用特异抗体检测特定蛋白在组织细胞内的表达和定位蛋白质芯片系统 基因转化实验和转基因结果分析 转基因载体的构建 载体 农杆菌 特殊抗生素植株的转化 叶盘转化法 基因枪植株的筛选 荧光检测 GUS染色 PCR法基因功能分析 激光共聚焦显微镜 FISH等 连接反应 在灭菌的0 5mL离心管中进行 10 L体积反应体系中 2 快速连接缓冲液5 L目的基因的双酶切产物X LpMal c2x质粒双酶切产物X LT4 DNA连接酶0 3 L 轻轻混匀 室温下放置过夜 注意事项 目的基因和c2x质粒双酶切产物的加入比例应根据电泳结果而定 使加入的2片段的浓度比为1 1 剩下的酶切片段不要丢掉 留做转化时做对照 感受态菌的制备 1 E coliTB1菌株37 过夜培养以复苏菌种 取过夜培养的菌液1mL加入到50mLLB培养基中 37 230r min振荡培养3h 至A600约为0 4左右 2 无菌条件下 将50mL菌液转移至离心管中 冰上放置10min 使培养物冷却至0 3 在预冷4 的离心机上以4000r min离心10min 弃去上清 加入5mL预冷的0 1mol LCaCl2溶液重悬沉淀 冰浴上放置10min 4 以4000r min在4 离心10min 弃去上清 每50mL初始培养物用2mL预冷的含有10 20 甘油的0 1mol LCaCl2溶液重悬细胞沉淀 100 L 管分装 于 70 条件下 可保存半年 注意事项 细胞一旦离开培养基 实验操作要轻柔 整个实验过程中注意将细胞置于冰上 不能摇过了 选用处于对数生长期的细胞 预先冷却 pMal ade重组质粒的转化 1 向分装有100 LE coliTB1菌株感受态细胞的EP管中加入2 L的上步中得到的连接混合物 轻轻旋转以混合内容物 冰浴上放置30min 2 将该EP管放入预加温至42 的水浴中 放置90s 快速转移到冰浴中 使细胞冷却1 2min 3 向EP管加入900 LLB培养基 转移至37 摇床上 150r min 温育45min以复苏菌株 4 将200 L上述培养物加到含100 g mL氨卞青霉素的LB平板上 平板表面涂有20mg mL的X gal40 L和20mg mL的IPTG40 L 以玻璃涂布棒轻轻地将转化细胞平铺于琼脂平板表面 5 将平板置于室温下至液体被完全吸收 倒置平皿 37 过夜培养 水浴温度要准确 热击时不要摇动EP管 UNIQ 10柱式质粒小量抽提 将过夜培养的1 2ml细菌12 000rpm离心15秒 彻底去除上清 加入100 lSolutionI 用枪头或振荡器充分悬浮细菌 加入200 lSolutionII 立即温和混匀 倾斜45度角 顺一个方向 慢慢旋转离心管 使细菌裂解 室温放置2分钟 加入350 lSolutionIII 立即上下颠倒5 10次 使之充分中和 室温放置2分钟 12 000rpm 离心5分钟 将步骤5中上清转移到套放于2 0 ml收集管内的UNIQ 10柱中 8 000rpm室温离心15秒 弃收集管中的废液 将UNIQ 10柱放入同一支收集管中 吸取500 lWashSolution到UNIQ 10柱 10 000rpm室温离心30秒 重复步骤7 弃收集管中的废液 将UNIQ 10柱放入同一支收集管中 10 000rpm室温离心30秒以彻底去除WashSolution 将UNIQ 10柱放入新的洁净1 5 ml离心管中 加50 lElutionBuffer 室温放置2分钟后 10 000rpm室温离心1分钟 离心管中的溶液即为所抽提的质粒DNA 注意 对于低拷贝数的质粒 请用2 5ml细胞 同时按比例相应提高SolutionI II和III的用量 在执行步骤5后 将上清分批加入到UNIQ 10柱中 重复步骤6 直至处理完所有样品 不能剧烈混合 否则会出现基因组DNA污染 不要吸取沉淀 否则会出现基因组DNA和蛋白质污染 1 如果要提高质粒的浓度 可以用30 lElutionBuffer 37 或50 下放置2分钟 10 000rpm室温离心1分钟 2 55 80 洗脱可提高回收率10 20个百分点 PCR筛选 1 调整模板 pMal ade重组质粒 浓度至5ng L 2 按下列体系配制反应混合液 混匀 TemplateDNA1 0 L 20ng 10 buffer2 0 LMgCl2 25mmol L 1 5 LPrimer1 10 mol L 0 5 LPrimer2 10 mol L 0 5 LdNTPs 2mmol L 2 0 LTaq酶 5U L 0 5 L加ddH2O至20 L 外源基因的特异引物 引物1 5 CCGGAATTCTTGAATAAAGAAGCGCTAGTC 3 和引物2 5 CGGGGATCCGTCGACTTATTGCAGTGATATGTGTTG 3 3 PCR反应循环条件设置94 变性反应1min 55 退火反应45s 72 延伸反应1min 进行25个循环后 最后一个循环72 延长至10min 迅速冷却4 4 检测加2 L溴酚蓝和10 L反应产物 混匀 取15 L反应产物点样电泳 5 成像分析在1 的琼脂糖凝胶上点样电泳0 5 1h 电泳结束后EB染色15 20min 凝胶成像分析结果 pMD18 TVector pMD18 TVector是一种高效克隆PCR产物 TACloning 的专用载体 这种载体由pUC18载体改建而成 在pUC18载体 参见第12章基因工程的载体 的多克隆位点处的XbaI和SalI识别位点之间插入了EcoRV识别位点 用EcoRV进行酶切反应后 再在两侧的3 端添加 T 而成 因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3 末端添加一个 A 的特性 所以使用这种制品可以大大提高PCR产物的连接 克隆效率 EcoRV T cloningsite cDNA文库应用分离新基因的方法 发现并分离克隆新基因始终是分子生物学研究的主要任务和目的 虽然cDNA文库的用途很多 但是 应用于分离新基因是其最重要的用途 前述的不管是哪种类型的cDNA文库 都可以用于分离新基因 只是使用的方法有差异 分离方法主要有两种 第一 对于非全长cDNA文库 即不管是经典的cDNA文库方法或差减法构建的cDNA文库 需要利用已经获得的新cDNA序列片段 通过RACE方法获得新基因的全长序列 第二 利用全长cDNA文库与目的基因片段作为探针的杂交筛选 从非全长cDNA文库中筛选新基因3 1 1RACE法RACE文库即快速扩增cDNA末端法 RapidAmplificationofcDNAEnd RACE 只需知道mRNA内很短的一段序列即可扩增出其cDNA的5 5 RACE 和3 端 3 RACE 该法的主要特是利用一条根据已知序列设计的特异性引物和一条与mRNA的PolyA 3 RACE 或加至第一链cDNA3 端的同聚尾 5 RACE 互补的通用引物 由于同聚体并非良好的PCR引物 同时为了便于RACE产物的克隆 可向同聚体引物的5 端内加入一内切酶位点 所用的cDNA模板可以使用多聚dT引物延伸合成 3 5 RACE均可 当RACEPCR产物为复杂的混合物时 可取部分产物作模板 用另一条位于原引物内侧的序列作为引物与通用引物配对进行另一轮PCR 巢式PCR 早在1988年 FROHMAN等即用此方法成功地获得了4种mRNA的5 合3 末端序列 用PCR法从cDNA文库中快速克隆基因通过对文库的筛选或适用简并引物进行PCR反应 常常只能获得不完整的cDNA片段 为了得到cDNA全长 常常要重新筛选文库 重新筛选文库工作量大 RACE虽然为此