水产品中硝基呋喃的测定.docx

XXX实验室检测中心管理体系文件作业指导书（第A版 第0次修改）文件编号：编写：审核：批准：批准日期：受控状态： 受控 非受控正副版本： 正本 副本持有者：发布日期： 实施日期：作业指导书文件编号：第1页 共8页标 题：水产品中硝基呋喃的测定第A版 第0次修改颁布日期：2014年 月 日1. 目的使硝基呋喃的测定处于受控状态，保证硝基呋喃检测结果的准确性与一致性；规范参加本项目检测工作人员的操作规程。2. 适用范围适用于水产品中硝基呋喃的测定。3. 引用标准动物组织中硝基呋喃类代谢物残留的测定 酶联免疫吸附法 SB/T 10927-2012出口动物源食品中硝基呋喃代谢物残留量的测定 酶联免疫吸附法 SNT 3380-2012无公害食品 水发水产品 NY 5172-2002分析实验室用水规格和试验方法GB/T 6682-2008食品卫生检验方法 理化部分 总则 GB/T5009.1-20034. 概述硝基呋喃类（Nitrofurans）药物是一种广谱抗生素，因价格较低且效果好，而广泛用于畜禽及水产养殖业，以治疗由大肠杆菌或沙门氏菌所引起的肠炎、疖疮、赤鳍病、溃疡病等。但由于硝基呋喃类药物及其代谢物对人体有致癌、致畸胎副作用,1995年起欧盟禁止硝基呋喃类药物在畜禽及水产动物食品中使用，并严格执行对水产中硝基呋喃的残留检测，2002年美国亦随之制定相应法规。5. 原理本方法的测定基础是竞争性酶联免疫反应，整个方法包括四种硝基呋喃代谢物残留量的检测。在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中的硝基呋喃代谢物残留物经衍生化后和微孔条上预包被的偶联抗原竞争相应的抗硝基呋喃代谢物的衍生物抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含硝基呋喃代谢物残留物的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应稀释倍数即可得出样本中硝基呋喃代谢物残留物的残留量。6. 试剂和材料 除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为去离子水。6.1. 乙酸乙酯。6.2. 正己烷。6.3. 1N盐酸溶液。6.4. 1N氢氧化钠溶液。6.5. 呋喃唑酮(AOZ)酶联免疫检测试剂盒作业指导书文件编号：第2页 共8页标 题：水产品中硝基呋喃的测定第A版 第0次修改颁布日期：2014年 月 日6.6. 呋喃它酮(AMOZ)酶联免疫检测试剂盒6.7. 呋喃西林代谢物(SEM)酶联免疫检测试剂盒6.8. 呋喃妥因(AHD)酶联免疫检测试剂盒7. 仪器和设备7.1. 微孔板酶标仪：波长450nm/630nm。均质器。7.2. 氮气吹干装置。7.3. 振荡器。7.4. 离心机：转速4000 r/min以上。7.5. 刻度移液管。7.6. 天平：感量0.01g。7.7. 微量移液器：单道20L200L，100L1000L、多道250L。7.8. 洗板机。8. 呋喃唑酮(AOZ)酶联免疫检测8.1. 样本处理8.1.1. 取1 g已均质样品置入离心管中，加入4mL H2O，0.5mL 1 M HCl，100L衍生试剂。8.1.2. 振荡混合约1分钟。8.1.3. 置60烘箱，静置3h。8.1.4. 加入5 mL1浓缩缓冲液，0.4mL 1M NaOH，5mL乙酸乙酯。8.1.5. 振荡混合约1分钟。8.1.6. 以离心机离心10分钟（3000 rpm）。8.1.7. 取2mL上层液（乙酸乙酯层）至10mL玻璃试管。8.1.8. 于50下，利用氮气将乙酸乙酯吹干(样品快速浓缩系统)。8.1.9. 在此玻璃试管中加入1mL正己烷，先将残余物完全溶解（若未能完全溶解，可能会导致回收率降低），再加入1.6mL1萃取/清洗液。8.1.10. 振荡混合约1分钟。8.1.11. 用离心机离心10分钟（3000 rpm） (若不分层则振荡混合后于沸水加热3分钟再离心一次) 。8.1.12. 取出下层液（水层）准备进行测试(一个检测需0.05mL)。稀释倍数: 48.2. 酶联免疫测定使用前将试剂盒置于室温（20-25）平衡 30min 以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将不用的微孔条放入自封袋，保存于 2-8不要冷冻；8.2.1. 将标准品对应微孔按序编号后分别加入50L标准溶液。8.2.2. 在其他的微孔加入50L已完成前处理的样品溶液。作业指导书文件编号：第3页 共8页标 题：水产品中硝基呋喃的测定第A版 第0次修改颁布日期：2014年 月 日8.2.3. 再于每一微孔另加入100L已完全回温的酶标记物。8.2.4. 轻敲酶标板四周，使其充分混合后于室温下避光静置30分钟。8.2.5. 将微孔中的反应液甩掉，再将清洗液加满每一微孔后甩掉，重复3次。8.2.6. 最后一次甩掉后，在吸水纸上拍干。8.2.7. 于每一微孔加入显色液100L后，轻敲酶标板四周，使其充分混合。8.2.8. 于室温下避光静置20分钟。8.2.9. 加入反应终止液，每一微孔加入100L。8.2.10. 酶标仪以单波长450nm或双波长450nm/650nm读值。9. 呋喃它酮(AMOZ)酶联免疫检测9.1. 样本处理9.1.1. 取1 g已均质样品置入离心管中，加入4mL H2O，0.5mL 1 M HCl，100L衍生试剂。9.1.2. 振荡混合约1分钟。置60烘箱，静置3h。9.1.3. 加入5 mL1浓缩缓冲液，0.4mL 1M NaOH，5mL乙酸乙酯。9.1.4. 振荡混合约1分钟。9.1.5. 以离心机离心10分钟（3000 rpm）。9.1.6. 取2mL上层液（乙酸乙酯层）至10 ml玻璃试管。9.1.7. 于50下，利用氮气将乙酸乙酯吹干(样品快速浓缩系统)。9.1.8. 在此玻璃试管中加入0.8mL正己烷，先将残余物完全溶解（若未能完全溶解，可能会导致回收率降低），再加入0.8mL1萃取/清洗液。9.1.9. 振荡混合约1分钟。9.1.10. 用离心机离心10分钟（3000 rpm） (若不分层则振荡混合后于沸水加热3分钟再离心一次) 。9.1.11. 取出下层液（水层）准备进行测试(一个检测需0.05mL)。稀释倍数: 29.2. 酶联免疫测定使用前将试剂盒置于室温（20-25）平衡 30min 以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将不用的微孔条放入自封袋，保存于 2-8不要冷冻；9.2.1. 将标准品对应微孔按序编号后分别加入50L标准溶液。9.2.2. 在其他的微孔加入50L已完成前处理的样品溶液。9.2.3. 再于每一微孔另加入500L已完全回温的酶标记物。9.2.4. 轻敲酶标板四周，使其充分混合后于室温下避光静置30分钟。9.2.5. 将微孔中的反应液甩掉，再将清洗液加满每一微孔后甩掉，重复3次。9.2.6. 最后一次甩掉后，在吸水纸上拍干。9.2.7. 于每一微孔加入显色液100L后，轻敲酶标板四周，使其充分混合。9.2.8. 于室温下避光静置20分钟。9.2.9. 加入反应终止液，每一微孔加入100L。作业指导书文件编号：第4页 共8页标 题：水产品中硝基呋喃的测定第A版 第0次修改颁布日期：2014年 月 日9.2.10. 酶标仪以单波长450nm或双波长450nm/650nm读值。10. 呋喃西林代谢物(SEM)酶联免疫检测10.1. 样本处理10.1.1. 取1 g已均质样品置入离心管中，加入4mL H2O，0.5mL 1 M HCl，100L衍生试剂。10.1.2. 振荡混合约1分钟。10.1.3. 置60烘箱，静置3h。10.1.4. 加入5 mL1浓缩缓冲液，0.4mL 1M NaOH，5mL乙酸乙酯。10.1.5. 振荡混合约1分钟。10.1.6. 以离心机离心10分钟（3000 rpm）。10.1.7. 取2mL上层液（乙酸乙酯层）至10 ml玻璃试管。10.1.8. 于50下，利用氮气将乙酸乙酯吹干(样品快速浓缩系统)。10.1.9. 在此玻璃试管中加入1mL正己烷，先将残余物完全溶解（若未能完全溶解，可能会导致回收率降低），再加入1.6 mL1萃取/清洗液。10.1.10. 振荡混合约1分钟。10.1.11. 用离心机离心10分钟（3000 rpm） (若不分层则振荡混合后于沸水加热3分钟再离心一次) 。10.1.12. 取出下层液（水层）准备进行测试(一个检测需0.1mL)。稀释倍数: 410.2. 酶联免疫测定使用前将试剂盒置于室温（20-25）平衡 30min 以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将不用的微孔条放入自封袋，保存于 2-8不要冷冻；10.2.1. 将标准品对应微孔按序编号后分别加入100L标准溶液。10.2.2. 在其他的微孔加入100L已完成前处理的样品溶液。10.2.3. 再于每一微孔另加入500L已完全回温的酶标记物。10.2.4. 轻敲酶标板四周，使其充分混合后于室温下避光静置30分钟。10.2.5. 将微孔中的反应液甩掉，再将清洗液加满每一微孔后甩掉，重复3次。10.2.6. 最后一次甩掉后，在吸水纸上拍干。10.2.7. 于每一微孔加入显色液100L后，轻敲酶标板四周，使其充分混合。10.2.8. 于室温下避光静置20分钟。10.2.9. 加入反应终止液，每一微孔加入100L。10.2.10. 酶标仪以单波长450nm或双波长450nm/650nm读值。11. 呋喃妥因(AHD)酶联免疫检测11.1. 样本处理11.1.1. 取1 g已均质样品置入离心管中，加入4mL H2O，0.5mL 1 M HCl，100L衍生试剂。11.1.2. 振荡混合约1分钟。作业指导书文件编号：第5页 共8页标 题：水产品中硝基呋喃的测定第A版 第0次修改颁布日期：2014年 月 日11.1.3. 置60烘箱，静置3h。11.1.4. 加入5 mL1浓缩缓冲液，0.4mL 1M NaOH，5mL乙酸乙酯。11.1.5. 振荡混合约1分钟。11.1.6. 以离心机离心10分钟（3000 rpm）。11.1.7. 取2mL上层液（乙酸乙酯层）至10 ml玻璃试管。11.1.8. 于50下，利用氮气将乙酸乙酯吹干(样品快速浓缩系统)。11.1.9. 在此玻璃试管中加入1mL正己烷，先将残余物完全溶解（若未能完全溶解，可能会导致回收率降低），再加入0.8mL1萃取/清洗液。11.1.10. 振荡混合约1分钟。11.1.11. 用离心机离心10分钟（3000 rpm） (若不分层则振荡混合后于沸水加热3分钟再离心一次) 。11.1.12. 取出下层液（水层）准备进行测试(一个检测需0.05mL)。稀释倍数: 211.2. 酶联免疫测定使用前将试剂盒置于室温（20-25）平衡 30min 以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将不用的微孔条放入自封袋，保存于 2-8不要冷冻；11.2.1. 将标准品对应微孔按序编号后分别加入100L标准溶液。11.2.2. 在其他的微孔加入100L已完成前处理的样品溶液。11.2.3. 再于每一微孔另加入50L已完全回温的酶标记物。11.2.4. 轻敲酶标板四周，使其充分混合后于室温下避光静置30分钟。11.2.5. 将微孔中的反应液甩掉，再将清洗液加满每一微孔后甩掉，重复3次。11.2.6. 最后一次甩掉后，在吸水纸上拍干。11.2.7. 于每一微孔加入显色液100L后，轻敲酶标板四周，使其充分混合。11.2.8. 于室温下避光静置20分钟。11.2.9. 加入反应终止液，每一微孔加入100L。11.2.10. 酶标仪以单波长450nm或双波长450nm/650nm读值。12. 结果判定12.1. 定性判定用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出样本所含硝基呋喃浓度范围(ng/ml)。假设样品1的吸光度值为0.313，样品2的吸光度值为1.032，标准液吸光度值分别是:0ppb为1.892；0.025ppb为1.501；0.05ppb为1.175；0.1ppb为0.751；0.3ppb为0.421；0.6ppb为0.198。则样品1的浓度范围0.3ppb-0.6ppb;样品2的浓度范围0.05ppb-0.lppb。(再乘以相应的稀释倍数)作业指导书文件编号：第6页 共8页标 题：水产品中硝基呋喃的测定第A版 第0次修改颁布日期：2014年 月 日12.2. 定量判定所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值(B)除以第一个标准(0标准)的吸光度值(BO)再乘以100%，即百分吸光度值。百分吸光度值%=BB0100%B标准溶液或样本溶液的平均吸光度值。BO0ng/ml标准溶液的平均吸光度值。以标准品百分吸光率为纵坐标，以硝基呋喃标准品浓度(ng/ml)的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中硝基呋喃的实际浓度。若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。13. 检测限、回收率和精密度13.1. 检测限AOZ和AMOZ的检测限为0.1ppb；SEM的检测限为0.2ppb；AHD的检测限为0.1ppb。13.2. 回收率AOZ: 80%120%；AMOZ: 75%115%；SEM: 80%120%；AHD: 70%130%；13.3. 精密度本方法的变异系数均小于l0%。13.4. 确证试验如被测样品中硝基呋喃代谢物残留量的值大于检测限时，应用仪器方法进行确证。14. 相关文件呋喃唑酮(AOZ)酶联免疫检测试剂盒说明书（广州瑞森生物科技有限公司）呋喃它酮(AMOZ)酶联免疫检测试剂盒说明书（广州瑞森生物科技有限公司）呋喃妥因(AHD)酶联免疫检测试剂盒说明书（广州瑞森生物科技有限公司）呋喃西林代谢物(SEM)酶联免疫检测试剂盒说明书（广州瑞森生物科技有限公司）天平称量操作规程高速离心机操作规程氮吹仪操作规程数显鼓风干燥箱操作规程全自动洗板机操作规程酶标仪操作规程作业指导书文件编号：第7页 共8页标 题：水产品中硝基呋喃的测定第A版 第0次修改颁布日期：2014年 月 日15. 注意事项15.1. 呋喃唑酮(AOZ)、呋喃它酮(AMOZ)、呋喃妥因(AHD)酶联免疫检测：（1） 将标准品6瓶、待测样品、10倍浓缩萃取/清洗液、10倍浓缩缓冲液、衍生试剂、浓缩酶标记物、酶标板、显色液、反应终止液，置于室温下，回温30分钟。（2） 1缓冲液配制用蒸馏水将10倍浓缩缓冲液以1:9的比例稀释（即50mL浓缩液+450mL蒸馏水），即可作为萃取步骤中调控 pH使用。1缓冲液一旦配制完成，请放置于28贮存（注：10倍浓缩缓冲液请确实回温后使用，并请检查溶液底部的结晶是否完全溶解。）（3） 1萃取/清洗液配制用蒸馏水将10倍浓缩萃取/清洗液以1:9的比例稀释（即50mL浓缩液+450mL蒸馏水），即可作为样品萃取回溶，浓缩酶标记物稀释与微孔清洗使用。1萃取/清洗液一旦配制完成，请放置于28贮存（注：10倍浓缩萃取/清洗液请确实回温后使用，并请检查溶液底部之结晶是否完全溶解。）（4） 衍生试剂乃配制于DMSO中，28保存会有结冰现象，若提供微温（30）的水浴将有助于加速溶解。此外，为避免DMSO挥发造成操作者不适，请于抽风柜内添加此试剂。（5） 1酶标记物配制用 1萃取/清洗液将 400倍浓缩的酶标记物以1:400之比例稀释（即30L浓缩酶标记物+12mL1萃取/清洗液），即为1的酶标记物（注：1的酶标记物请于每次使用前新鲜配制，未使用完的请丢弃）。（6） 用剩余的测试条孔则放回铝箔袋，将封口封好后储存于28冰箱。15.2. 呋喃西林代谢物(SEM)酶联免疫检测：（1） 使用前请先将试剂盒回温至室温(置于室温60分钟以上)，各溶液皆摇匀后方可