离体器官、组织实验方法总论.doc

离体器官、组织实验方法总论一 概述 离体器官、组织实验是将动物的某些器官或组织从体内取出放入生理代用液中，根据不同的实验目的和不同种属动物特点进行恒温，通氧或恒温灌流及建立与动物机体内环境基本相似的人工环境，保证脏器或组织维持正常活动状态。在此基础上通过一定的检测手段观察其生理活动、病理变化以及各种药物和试剂等施加因素对其生理生化及形态变化的影响。离体实验方法可排除整体情况下体内各种复杂因素的干扰，直接观测离体标本的各项指标。整体情况下体内各种复杂因素有那些呢？主要有：精神支配；激素的影响。离体实验方法对各种施加因素可进行人为调节，实验环境可进行严格控制，方法精确，研究深入，有利于分析作用机理及对药物的药效作定量研究，可获得准确、精细的结果。但也存在一些缺点和局限性。1 它失去了机体完整统一的内环境和神经体液调控作用。2 失去了体内各种组织、细胞之间的正常比例和相互关系，与临床状态相距较远。3 容易受到外环境各种因素的干扰。不能用于研究药物对精神状态方面的影响。4 有些药物必须经体内代谢成活性形式才有药理作用，在离体实验有时得不到正确结果。5 体外实验所用的药物剂量、浓度、酸碱度、离子含量等，都会影响实验结果。 因此，不能用于研究药物对精神状态方面的影响。对于一种机理的论证，必须结合整体实验结果加以阐明。目前在国际上生命科学文献中离体实验资料越来越多，特别是细胞分子生物学水平的研究已是近年来生命科学研究的新 趋势。离体实验研究水平： 器官、组织水平 细胞水平 亚细胞水平 分子水平 量子水平 离体实验方法在教学上主要研究器官、组织水平二离体器官、组织实验常用方法 离体器官、组织实验常用方法有：离体心脏、离体骨骼肌、离体平滑肌实验法等。1离体心脏心脏是血液循环的动力装置。离体心脏实验研究方法很多。主要有： 优点：可在短时间内可以获得较多的有价值的分析性资料。当然一定要在仪器的准确控制之下，直接观察记录它的活动反应，可排除一切复杂因素和人为控制作用因素，可以从质和量上掌握研究对象的活动与反应。 不足之处：是离体心脏实验不能完全说明心脏在整体情况下的功能活动规律。 2离体骨骼肌骨骼肌是随意肌。骨骼肌的研究方法多数是离体实验。在适当的人工环境下，通过一定的检测手段观察记录以研究骨骼肌收缩的力学特性、神经肌肉兴奋传导、生物电现象等。还可以进一步研究肌肉收缩的微细变化。 3离体平滑肌平滑肌是不随意肌。平滑肌不象骨骼肌和心肌那样是一个单一机能的组织。平滑肌广泛分布于机体的消化、血管和泌尿生殖系统，结构和收缩机能较为复杂。在实验生理科学实验中，离体平滑肌实验方法用得较多。通常使用的离体标本为哺乳类动物的气管、胃底、小肠、胆囊、胆管、动脉条、子宫、输精管、输尿管等。在适当的人工环境下研究平滑肌机械收缩变化、生物电变化、各种因素和药物的影响及作用原理等。三离体器官、组织实验一般知识1. 标本的制备 在进行标本制备时必须根据所用标本选择适当的动物。标本的制备我们在做具体实验时再讲（示范）。 标本制备时为了顺利地取得脏器，应尽量减少对其正常生理功能的影响。处死的方法要迅速，避免使用化学、药物及其它一切影响机体内环境的方法。根据动物的解剖特点，分离并摘取所需组织器官，并制成标本。 离体实验常采用的标本有离体心脏标本；离体骨骼肌标本；离体平滑肌标本等。2.人工环境的建立在进行离体器官和组织实验时，为了使标本在离体的情况下，还能在一定的时间内保持其近似正常的生理活动，必须尽可能地使标本所处的环境和机体内相似，即用人工的方法模拟出机体内环境人工环境，有赖于生理代用液和恒温、通气、恒流的建立。（1）生理代用液 其理化特性（电解质、渗透压、酸碱度、温度等）与体液（组织外液）相近似，故用于离体器官组织实验，可以较长时间维持标本的“正常”机能活动。生理代用液的基本要求如下。 电解质- 溶液中含有一定比例的不同电解质的离子如Na+Cl-、K+、Ca2+、Mg2+、H+、OH-等，是维持组织和器官的功能所必需的。动物组织器官不同，对生理代用液中离子的成分和浓度的要求同。如：离体回肠台氏液离体蛙心脏任氏液离体气管克氏液离体子宫乐氏液等渗- 不同动物对同一种物质的等渗浓度要求不相同，如生理盐水溶液，冷血动物应用0.60.75%，而恒温动物应用0.9%。pH值- 生理代用液的pH一般要求在7.07.8之间，否则会影响组织器官的功能。如酸性生理溶液可使哺乳动物的冠状动脉扩张，碱性溶液则使之收缩；酸性生理溶液可使平滑肌松弛，碱性则使其节律加速，振幅缩小。所以，为了调节和稳定生理代用液的pH值，常在生理代用液中加入缓冲液。常用的缓冲对为K2HPO4/KH2PO4、Na2CO3/NaHO3等。能量、营养物- 离体实验中一般用葡萄糖提供组织活动所需的能量。（2）恒温装置 - 温血动物的离体标本实验必须在恒温条件下进行。恒温装置为与超级恒温器相连的麦氏浴槽。恒温工作点根据不同标本而定。如：离体回肠为38c,离体子宫为32c。 注意：冷血动物不需要恒温。（3）通气装置 - 在离体器官、组织实验中通气的目的在于供氧，通常给予95%的氧气和5%二氧化碳的混合气体（纯氧可使pH值升高，加入二氧化碳以维持pH值相对稳定）。通气的方法有直接通气和间接通气两种方法。直接通气法是把通气管伸到标本槽底部，缓慢地放出小而均匀的气泡，气泡太大可能会影响标本机能活动的检测。间接通气法是在生理代用液中预先通气，再灌流标本。（4）恒流装置 - 为了保持离体标本处于与体内相似的血液灌流状态，由超级恒温器、冷凝管和蠕动泵构成横流装置，使生理代用液以一定的流量灌流标本，不断提供新鲜的液体，并不断清除组织器官的代谢产物。四检测方法实验生理科学实验常用的方法有杠杆法、传感器法等。1. 杠杆法 通过杠杆的机械放大作用，将标本张力的变化直接描记在记纹鼓上，按杠杆原理，标本连接的动力臂短，连接描笔的阻力臂长，二者的长短比例即其放大倍数，一般为1：3。在阻力臂加13克的负荷（预应力），可以观察标本的等张性活动。该方法的灵敏度较差，对一些活动幅度小的变化难以记录，并且杠杆摆动的惯性大，记录准确度较差。但本法简单易行，是一般实验（或实验条件较差）常用的方法。2. 传感器法 用张力换能器将标本活动的机械变化转换成电变化，直接将换能器的输出与生理记录仪的放大器或与微机生理信号处理系统相连。该方法灵敏度较高，能精确地显示或记录。 根据所测的生理机械力的大小，可采用不同量程的张力换能器，一般量程在3050克。3. 生物电法 分为细胞与细胞外电极法。不讲。二 观察指标1. 频率变化 心脏、肠道、子宫器官都具有自主节律的特点，在离体实验中可观察其活动的频率。通常以“次/min”来表示。2. 节律变化 表示收缩曲线的规律性。3. 强度（幅度）变化 以每次收缩所达的最高点表示。4. 张力变化 以各次收缩之间的最低点表示，即曲线基线。基线抬高即张力升高，基线下降即张力降低。5. 活动力 变化 以强度和频率的乘积表示。6. 心输出量变化 可用“滴/min”表示，亦可用单位时间的毫升数“ml/min”表示。7. 电活动变化 心脏用心肌细胞动作电位观察电活动，胃、肠、子宫等的电活动主要观察动作电位和周期性慢波变化。8. 脏器、组织分泌产物或组织中成分的变化 收集灌流液或组织、细胞匀浆，进行分离、纯化处理，然后作进一步的分析和测定。扬 州 大 学 医 学 院 教 案教师姓名 夏叶玲 课程 机能实验学 专业 医学本科 班级 年 月 日题目 受体激动药对离体子宫的作用 学时 5 教学方式 教学目的1掌握离体子宫标本的制备方法。2、观察受体激动药对离体子宫的作用。讲授提纲及时间分配1. 讲授15分钟，2. 课件10分钟，3. 学生实验175分钟，4. 数据统计及总结20分钟。难点与重点1、离体子宫标本的制备法；2、MSP-007生物信号处理系统的应用；教具1.机能实验学课件。复习思考题1.为什么先滴加催产素，然后再加入拟肾上腺素类药？2.子宫平滑肌自律性为何很弱？3.子宫平滑肌节律性收缩不好，为什么？其他1.复习子宫上的2.介绍子宫的介剖结构图实验三 受体激动药对离体子宫的作用一、目的与原理：1掌握离体子宫标本的制备方法。2、观察受体激动药对离体子宫的作用。大白鼠子宫上受体有肾上腺素、2受体，子宫以肾上腺素型受体占优势，2受体兴奋时子宫抑制，受体兴奋时子宫需在雌激素水平占优势时，才致收缩，反之无收缩作用。大白鼠子宫上受体以肾上腺素型受体占优势，所以适用于研究受体兴奋剂和受体阻断剂，由于子宫平滑肌自发性节律性不规则，收缩强度也不一致，在研究抑制子宫活动的药物时，通常用药物兴奋子宫，以引导子宫规律性兴奋。在此基础上研究待试药物。二、材料与药品1、动物：大白鼠，200250g，雌性。2、器材大白鼠手术器械一套，张力换能器，MSP007生物信号处理系统，恒温装置一套，铁支架，双凹夹，试管夹，滴管，烧杯，恒温水浴箱，丝线等。3、药品10-3去甲肾上腺素（noradrenaline，NA）， 10-3肾上腺素（adrenaline，AD），10-3异丙肾上腺素（isoprenaline，IS）， 5/ml垂体后叶素（pituitrin），乐氏液。 NA是去甲肾上腺素能神经末梢释放的主要递质，药用为人工合成品，主要作用于12受体对2受体几无作用。AD是肾上腺素髓质的主要激素，药用多为人工合成品，主要作用于、受体。IS为人工合成品，主要作用于受体。Pituitrin为子宫平滑肌兴奋药，内含缩宫素和加压素。三、方法：1.术前准备（MSP-007系统操作）1）依次选择输入：通道2无输入；通道3无输入； 通道4张力。按提示自动调零，调零后再将线调至适宜程度。2）控制选择：增益选择：4通道4。显速选择：1mm/s 横向压缩比为1：2；纵向为520g（横向、纵向调节可根据实际情况而定）。2. 子宫的介剖结构子宫的形状与人不一样，子宫为“V” 型形状，有两个子宫体，所以一只大白鼠可以做两个离体子宫标本。子宫的介剖结构图3.制备子宫标本（看机能课件的同时讲解子宫标本制备）用颈椎脱臼法处死大白鼠，剖腹取出子宫，立即置于盛有饱和乐氏液平皿中。轻柔剥离附着于子宫壁上的结缔组织，将一侧子宫角的两端用丝线结扎，放于标本槽中。4.实验装置 宫标本标本恒温工作点为32，浴管内充入50ml32左右的乐氏液，将张力换能器与生理信号处理系统相连，并通过双凹夹固定在万能支架上。将子宫标本标本与张力换能器连接。5.标本连接将标本置于浴管中，打开调节气流量的开关，使气泡一个一个逸出为宜。注意事项：1、剥离子宫时，动作要轻柔。2、张力换能器与标本间的连线要垂直，松紧度要适宜。四、实验结果数据结果为子宫收缩力，为配对计量资料。要求将实验室8个小组的数据进行初步统计（计算均数标准差），计算受体激动药对子宫收缩力的抑制率（%），并作出数据三线表和直方图。 用药前收缩幅度用药后收缩幅度子宫收缩抑制率= （100%） 用药前收缩幅度表1 受体激动药对子宫收缩力的影响药物 用药前收缩幅度（g） 用药后收缩幅度（g） 抑制率（%） 1 2 3 4 5 6 7 8 s 1 2 3 4 5 6 7 8 s 10-3去甲肾上腺素10-3肾上腺素10-3异丙肾上腺素 N NA AD IS 药物 图1 受体激