基因芯片技术及其应用PPT课件.ppt

基因芯片技术及应用示例 1 目 录 1 2 3 4 5 定义 基因芯片的分类 基因芯片的原理 基因芯片技术的四个技术环节 基因芯片技术的应用 2 定义 基因芯片技术是指采用寡核苷酸原位合成或显微打印手段 将数以万计的DNA探针固化于支持物表面上 产生二维DNA探针阵列 然后与标记的样品进行杂交 通过检测杂交信号来实现对生物样品快速 并行 高效地检测或医学诊断 特点 高通量 高集成 微型化 平行化 多样化和自动化 3 基因芯片的分类 按其片基不同可分为 无机片基芯片和有机合成片基芯片 按其应用不同可以分为 表达谱芯片 诊断芯片 检测芯片 按其结构不同可分为 DNA阵列和寡核苷酸芯片 按其制备方法不同可分为 原位合成芯片和合成后交联芯片 合成后点样芯片 4 基因芯片的原理 基于核酸分子碱基之间 A T G C 互补配对的原理 利用分子生物学 基因组学 信息技术 微电子 精密机械和光电子等技术将一系列短的 已知序列的寡核苷酸探针排列在特定的固相表面构成微点阵 然后将标记的样品分子与微点阵上的DNA杂交 以实现对多到数万个分子之间的杂交反应 并根据杂交模式构建目标DNA的序列 从而达到高通量大规模地分析检测样品中多个基因的表达状况或者特定基因 DNA 分子是否存在的目的 5 基因芯片技术的四个技术环节 1 芯片的制备主要是原位合成法和直接点样法 原位合成法适用于寡核苷酸 点样法多用于大片段 有时也用于寡核苷酸 原位合成法包括光导合成法和压电合成法 其优点是反应量大 探针的密度高并且可以和其他芯片制备方法结合使用 该方法的缺点是探针的长度较短 一般为20 50bp 点样法包括接触式点样和非接触式点样又称喷墨式打印 因点样法成本高 故适用于芯片上需要同一探针或是探针是长链DNA 6 2 样品制备与标记从待检细胞或组织中分离出DNA或RNA 经逆转录 PCR扩增 末端标记等操作 标记主要有荧光标记 生物素或同位素标记 现在常用荧光素标记 以提高检测的灵敏度和使用者的安全性 3 杂交反应属于固 液相反相杂交 探针分子固定于芯片表面 与液相的靶分子进行反应 但杂交条件的选择需考虑多方面的因素 如杂交反应体系中盐浓度 探针G C含量和所带电荷 探针与芯片之间连接臂的长度及种类 检测基因的二级结构的影响 由于基因芯片影响因素很多 所以要合理设置异种核酸平行实验 核酸质量 检测对照 封闭对照 归整化对照 以保证结果的准确性和重复性 7 4 信号检测和分析当芯片杂交完毕之后 需要对信号进行收集和分析 使用的标记物不同 相应的检测方法也各异 常用的荧光标记法使用激光共聚集荧光扫描仪进行信号检测 激光共聚焦扫描仪的激光光源可产生激发不同荧光染料的光 当探针与待测核酸完全正常配对时的荧光信号强度是具有单个或 个错配碱基探针的5 35倍 而且荧光信号的强度还与样品中靶分子的含量呈一定的线性关系 新发展的纳米金标记 通过银放大后可直接用肉眼观察 具有非常好的灵敏度 超过荧光标记法100倍 和特异性 8 9 基因芯片技术的应用 一 在食品中的应用1 细菌检测细菌污染是食品最常见的污染 食品中病原性细菌检测是食品卫生安全检测中一个重要的方面 Anthony等人建立了1个在4h以内致病细菌的快速诊断方法 他们运用该法158例经血培养鉴定为阳性的样品进行检测 结果符合率为79 7 Carl等在对4种细菌 即大肠埃希菌 痢疾杆菌 伤寒杆菌 空肠弯曲菌采用了基因芯片的检测方法 其检测结果不仅敏感度高于传统方法 且操作简单 重复性好 并节省了大量时间 大大提高了4种细菌诊断效率 10 2020 1 8 11 2 转基因食品的检测转基因食品的安全性现在还有很大的争议 利用基因芯片技术可以快捷准确的检测出样品是否为转基因食品 只需将目前通用的报告基因 抗性基因 启动子和终子的特异片断制成检测芯片与待测产品的DNA进行杂交 就可以判断待测样品是否为转基因产品 该技术检测的可靠性已被对大豆 玉米 油菜 棉花等农作物样品的检测结果所证实 另外 利用该技术也可以筛选转基因所需要的目的基因 12 3 对食品营养成分的检测传统的检测方法对食品的营养成分检测是非常繁琐的 更不用说对不同食品的类别和性质进行真伪鉴定了 基因芯片技术可用来研究食品的营养成分 对食品的类别和性质进行快速准确的鉴定 Lyakhovich等应用DNA芯片技术检测1 25 二羟维生素D3处理过的乳腺癌细胞的FGF 7的表达 发现无论在mRNA水平还是在蛋白水平都有明显的增加 从而首次揭示了维生素D可能通过调节FGF 7的表达而调节细胞的生长分化 13 二 在医药领域的应用1 用于药物作用新靶标的发现运用基因芯片技术能够比较正常组织细胞及病变组织细胞中大量 可达数千 基因的表达差异 从而发现一组疾病相关基因或致病新基因作为药物筛选靶标 14 用于药物作用新靶标的发现KumarSinha等利用DNA芯片筛选发现 在乳腺癌及其他癌细胞中 均检测到脂肪酸合成酶 fattyacidsynthesis FAS 基因过度表达 酪氨酸激酶抑制剂抑制FAS基因表达可诱导乳腺癌细胞的凋亡 表明FAS基因及其相应的信号通路与乳腺癌的发生有关 可能被用来作为治疗或药物筛选的新靶标 Mandel等利用基因芯片建立帕金森病的基因表达指纹 finger prints 图谱 发现了多种有利于抗帕金森病药物研制和开发的潜在药靶 15 2 用于药物有效成分的筛选如何分离和鉴定药物的有效成分是目前药物开发遇到的重大障碍 基因芯片技术是解决这一障碍的有效手段 如在寻找HIV药物中 Jellis用组合化学合成DNA芯片技术筛选65453种硫代磷酸八聚核苷酸 并从中确定了具有XXG4XX样结构的抑制物 实验表明 这种筛选物对HIV感染细胞有明显阻断作用 16 三 在植物研究中的应用 1 基因表达水平的检测植物基因的表达受遗传 环境或生化信号的影响 并且具有时空特异性 组织器官的基因只在某个特定的情况下才会表达 表达量也有很大差异 形成不同的基因表达谱 基因表达谱能够用来帮助理解植物体内功能基因的不同表达情况 可以揭示基因的功能以及它们在植物生理生化代谢途径中的作用 17 基因表达水平的检测 Schena等采用拟南芥基因组内共45个基因的cDNA微阵列 其中14个为完全序列 31个为EST 检测该植物的根 叶组织内这些基因的表达水平 用不同颜色的荧光素标记逆转录产物后分别与该微阵列杂交 经激光共聚焦显微扫描 发现该植物根和叶组织中存在26个基因的表达差异 而参与叶绿素合成的CAB1基因在叶组织较根组织表达高500倍 18 2 基因多态性分析及突变性检测将基因芯片技术用于检测分子突变 不仅可准确地确定突变位点和突变类型 更主要的是它的快速高效是目前所用的其他方法无法比拟的 基因芯片可以同时检测多个基因乃至整个基因组的突变 还可研究基因 组 的多态性 这将大大促进植物育种科学的发展并促进植物新品种的产生 研究突变性和多态性对检测防治植物疾病 探究分子突变与环境的关系 促进植物育种和植物新品种的产生等有积极意义 19 小结 目前 基因芯片技术飞速发展 广泛应用于基因表达分析 基因诊断 药物筛选 序列分析等诸多领域 而且而且在农业 工业 以及食品