法医-法医物证学PPT课件.ppt

法医物证学 Forensicgenetics 1 一 概述法医物证学是研究与法律有关的生物学检材的个体识别鉴定及亲子鉴定的法医学科 1 物证 materialevidence 对案件的真实情况有证明作用的物品和痕迹叫作物证 2 生物学检材 biologicalmaterials 涉及人体器官 组织 分泌物及排泄物等的有关物证叫作生物学检材 又称法医物证 或生物物证 3 物证检验 凡以侦察 审判为目的 对与案件有关的物品 痕迹进行检验鉴定 以判定物证是否能够作为肯定或否定证据的过程叫作物证检验 2 个体识别 personalidentification 亲子鉴定 parentagetesting 法医物证学的主要任务 3 二 遗传标记 一 概述1 遗传标记 geneticmarker GM 指人类受遗传控制的个体特征 具有受遗传控制和终身不变两个特征 传统遗传学概念 性状 character 遗传标记主要是指由单基因座控制的性状 遗传标记检测方法 免疫学技术检测生物化学方法分子生物学方法 4 遗传标记是由同一基因座上不同等位基因所控制 遗传学多态性的原因是基因座位出现等位基因 例如 ABO基因座染色体定位 9q34等位基因 allele 有 A B O基因型 genotype 有 AA AO BB BO AB OO表型 phenotype 有 A B AB和O等4种 5 遗传标记的传递遵循孟德尔遗传规律 同基因座等位基因在配子形成过程中彼此分离 分别进入各自的配子细胞 分离律 不同基因座等位基因在配子形成过程中 可分可合 随机组合进入同一配子细胞 自由组合律 6 2 遗传学多态性 geneticpolymorphism 通过某类型遗传标记的检测 可以将人群分开成若干类型的现象叫作遗传学多态性 从遗传学角度给遗传学多态性下一个定义 由2个或者2个以上等位基因控制的性状的个体差异 等位基因频率在0 01 0 99之间 7 3 分类 基因表达产物 蛋白 水平标记 血液各成分中的遗传标记均是基因的表达产物 具有个体差异 红细胞血型 RBCbloodtype 酶型 isoenzymetype 血清型 serumtype 白细胞抗原 humanleukocyteantigen HLA DNA分子水平标记 8 9 二 DNA遗传标记DNA多态性原因是在特定的基因座 locus 上 因碱基的突变 mutation 出现了等位基因 allele 且等位基因在个体得以保留 并按照孟德尔遗传规律由亲代向子代遗传 DNA遗传标记等位基因形式 等位基因的片段长度差异 等位基因的序列差异 10 1 DNA长度多态性 DNAlengthpolymorphisms 人类基因组DNA长3 109bp 编码基因序列约占不到5 非编码序列包括间隔序列 基因调控序列 基因内含子等 真核基因的内含子序列占基因序列的5 30 基因组DNA中大约10 是串联重复 tandemrepeats DNA 结构形式是以一个序列相对恒定的DNA片段构成核心序列 coresequence 作为重复单位 首尾相接 串联重复 这种特殊的串联重复序列叫作 卫星DNA satelliteDNA 11 卫星DNA分类 按照核心序列的碱基结构特征 卫星DNA分为 大卫星 macrosatelliteDNA 小卫星 minisatelliteDNA 微卫星 microsatelliteDNA DNA长度遗传标记主要位于小卫星和微卫星DNA序列中 12 大卫星 是一类核心序列具有相近的碱基构成 相近的浮力密度的卫星DNA 早年对基因组DNA等密度梯度离心研究中 在主要区带外存在若干个次要成分 序列分析证实是卫星DNA 分卫星 和 卫星等 按照浮力密度相近的分为一类 又称经典卫星DNA classicalsatellite 大卫星中的序列多态性在法医学应用无多大的价值 13 小卫星和微卫星小卫星和微卫星是依据核心序列的长度人为地分类 小卫星重复单位 15 30bp 重复次数数次至数百次 微卫星重复单位 2 6bp 重复次数次至数十次 小卫星和微卫星是DNA长度多态性的主要序特征性序列 14 可变数目串联重复序列小卫星和微卫星都具有特定的基因座位 其中部分卫星DNA序列 因不同个体 不同等位基因之间 重复单位的串联重复的次数不同形成了DNA片段长度差异 称作可变数目串联重复序列 variablenumberoftandemrepeats VNTR VNTR序列大约占一半左右 是构成DNA片段长度多态性的主要原因 15 16 17 18 小卫星序列都位于基因组高变区 是基因组中的重组热点 其中VNTR序列呈现极其复杂的长度多态性 例如 某小卫星VNTR座位重复单位17bp 重复次数70 450次则最短的基因长 17bp 70 1190bp最长的基因有 17bp 450 7650bp等位基因数应为 450 70 1 381个基因型数为 381 380 1 2 72771个 19 早期的法医DNA分型是针对小卫星靶序列 应用限制性片段长度多态性 restrictionfragmentlengthpolymorphism RFLP 分析 RFLP图谱具有高度个体特异性 被称为DNAfingerprint 以小卫星核心序列为探针 对人类基因组DNA作RFLP分析 显示图谱类似超市商品条码 由10 30条谱带组成 不同个体间 谱带数目不同 谱带的位置不同 人群中随机两个体的DNA指纹完全相同的几率为10 12 10 19 法医物证鉴定 从蛋白质水平进入DNA水平 实现从否定到认定的飞跃 20 21 随机10个体DNA指纹图谱探针 珠蛋白 3 HVR限制酶 HinfI 22 1 2 4 5 6 7 均为随机个体 3为凶器上血痕 与现场收集的血痕的DNA指纹一致 23 图中现场血痕与作案凶器上的血痕经过DNA指纹检测 有18条长度相同片段 群体调查汉族人群 每一片段出现平均频率为0 198 按照Jeffreys提供的匹配概率 Pm值 计算方法 Pm 0 19818 2 19 10 13 24 微卫星 microminilliteDNADNA重复单位2 6bp 重复次数10 30次 又称短串联重复序列 shorttandemrepeats STR 或simpletandemrepeats 其中大约有一半具有VNTR序列特征 是目前应用最普遍的一类标记系统 目前在人类基因组中发现STR座位有8000余个 25 3 STR分型基本技术PCR STR分型技术 参照STR重复序列的侧翼序列设计引物 PCR扩增STR片段长度等位基因 扩增产物用聚丙烯酰胺 polyacrylamidegel PAG 凝胶电泳分离 不同长度等位基因按重复次数 allelicladder 参照 以重复次数命名等位基因 银染技术 电泳分离后用银染显带 26 27 D16S539 D7S820 D13S317 D5S818四STR基因座复合扩增分型图谱 28 荧光标记PCR引物 扩增产物携带荧光 毛细管电泳 然后利用激光激发荧光显色基团 检测仪自动记录荧光波长和迁移率 由genotyper软件 自动分型 1 不同荧光标记引物 致等位基因扩增产物携带有荧光示踪基团 按不同波长区分基因座 2 在毛细管电泳中 记录电泳加样点至检测窗口的时间 迁移时间表示片段长度 29 30 31 AmpFlSTR Identifiler 等位基因分型标准参照图 32 3等位基因片段长度多在300bp以下 适用于腐败 降解 陈旧法医检材 4种属特异性好 引物具有人的种属特异性 材料中混合有动物血痕 不影响人血的STR分析 5复合扩增 提高单次检测的信息量 常规使用10 16个STR基因座 识别能力达到DNA指纹的鉴别水平 6实现标准化 自动化的分型 加上计算机技术辅助 建立全国范围的罪犯DNA数据库成为现实 33 三个样本的Identifiler 基因座等位基因分型图 34 PCR STR分型的技术优势 1高灵敏度 利用PCR的高灵敏度特征 理论上单个细胞的DNA可以扩增出靶DNA片段 目前法医学鉴定的灵敏度达到ng级DNA水平 2高特异性 针对靶基因座侧翼序列设计的PCR引物 引物的特异性决定了扩增产物的特异性 35 2 DNA序列多态性在基因组特定的基因座位 等位基因的碱基序列差异构成的多态性叫作序列多态性 sequencepolymorphism 序列多态性形成的主要原因是点突变 在同基因座位上 因为碱基的替换构成不同等位基因的序列差异 可以出现在编码区 也可以出现在非编码区 36 人类线粒体DNA mitochondrialDNA mtDNA是唯一的核外DNA 呈环状裸露的双股螺旋结构 分重链 H 和轻链 L 长度16569bp 编码37个与氧化磷酸化相关的蛋白质和RNA 其中有5 7 的序列为非编码区 成为控制区 controlregion 长度大约1100bp 在控制区碱基序列处于高度变异状态 大约2 3的碱基有变异 大约90 为转换 10 为颠换 37 38 三 群体遗传学基础在法医学鉴定中 为了给法庭说明鉴定结论的意义 必须将鉴定结论进行量化 其中涉及到群体遗传的基础理论 1概念 表型频率 phenotypefrequence 应用分型技术对人群分型检测 不同表型在人群中所占的比例就叫作表型频率 例如A在人群中占23 B 19 AB 9 O 49 39 基因频率 genefrequence 群体中某一等位基因占该群体中可能出现的等位基因总数的比例 例如 维族调查1513人的MN血型 M型689人 0 3893 MN型713人 0 4712 N型211人 0 1395 因此 M 2 689 713 2 1513 0 6249 N 2 211 713 2 1513 0 3751 40 总结计算公式为 基因频率 纯合子个体数 2 杂合子人数2 观察总人数注意 一个基因座所有等位基因频率的和等于1 41 42 2遗传平衡定律 Hardy Weinbergequilibrium 假设前提 群体无限大 婚配随机 没有突变 没有任何形式的选择 结论 该群体中各等位基因频率保持累代不变 43 44 总结上式 pA1 qA2 2 p2A1A1 2pqA1A2 q2A2A2因此 在达到遗传平衡的群体 基因频率和基因型频率间成 二项式展开数学式 的关系 1 纯合子基因型频率 该基因频率的平方 2 杂合子基因型频率 两基因频率乘积的2倍 45 例如 M 0 6249 N 0 3751则表型频率为 M 0 62492 0 3905MN 2 0 6249 0 3751 0 4699N 0 37512 0 1407按照H W平衡定律的结论 可以从基因频率计算出遗传标记表型的频率 作为 匹配概率 以评估两份检材是否来自同一个体 46 3匹配概率 当检材和样本经过分型鉴定 表型一致 称为匹配 match 匹配概率 matchprobability Pm 是指需要作个体识别的两份检材 经过鉴定 基因型相同 假设 检材 和 样本 不是来自同一个体 因为偶然的机会相同的机会 这个概率就是该基因型在人群中的频率 例如凶器上血痕与被害人血都是A型 随机匹配概率为0 23 47 累计匹配概率 CPm 等于各个标记的表型频率的乘积 条件是各个遗传标记系统是独立遗传 之间没有遗传连锁关系 乘法原则 48 例如 一把匕首上血痕与被害人血经过8个STR基因座测定 结果如下 49 生物检材的个人识别 血痕检验 精液斑检验 唾液斑检验 毛发检验 骨骼检验 牙齿检验 其它组织的检验 50 一 血痕检验血痕检验的主要内容 是否血痕 是人血还是动物血 血痕遗传标记分型检测即个体识别 51 一 预试验预试验属于筛选试验 将不是血痕的斑迹筛选出来 常用灵敏度高 操作简单的试验 联苯胺试验 Benzidinetest 原理 血痕中血红蛋白 正铁血红素具有过氧化酶活性 能是过氧化氢释放新生态氧 将无色的联苯胺氧化成联苯胺蓝 试剂 冰醋酸 联苯胺乙醇溶液 30 H2O2 操作 取少量可疑血痕置白色反应板上 1滴冰醋酸 1滴过氧化氢 1滴联苯胺液 立即出现兰色为阳性反应 52 53 2020 1 8 54 注意事项 高灵敏度 血液50万倍稀释 仍可出现阳性结果 两类干扰物质 含有过氧化物酶的植物 蔬菜和水果 可以出现假阳性 氧化剂可直接将联苯胺氧化 呈兰色变化 所以试验阳性不能认为可疑斑迹是血痕 只能结论 可能是血痕 联苯胺试验的意义在阴性结果 阴性结果可以排除血痕 55 二 确证试验 血色原结晶试验 hemochromogencrystaltest 原理 在碱性条件下正铁血红素分解成血红素和变性珠蛋白 正铁血红素在还原剂作用下还原成血红素 血红素与含氮物质吡啶结合生成樱桃红色针状 菊花状结晶 试剂 NaOH 葡萄糖 吡啶 Takayama试剂 操作 出现樱桃红色针状 菊花状结晶为阳性 56 血色原结晶 LessonITakayamaCrystal TakayamaCrystal 57 注意事项 特异性好 凡血痕检材可出现阳性结果 凡出现典型的血色原结晶的检材就是肯定是血痕 灵敏度不高 血液稀释200倍就难以获得典型的血色原结晶 凡稀释 雨淋 细菌污染和腐败血痕难出现典型结晶 所以血色原结晶试验的意义在阳性结果 阴性没有意义 需要继续作种属试验 58 三 种属试验种属鉴定是血痕鉴定的关键 动物学中存在血型物质 例如鸡有A型抗原物质 未确证人血即作ABO血型测定 可造成错案 自然界广泛存在与人类血型抗原类似的物质 微生物如大肠杆菌 肺炎双球菌 细菌污染的腐败血痕可能测定出ABO血型 59 环状沉淀 ringprecipitation 反应原理 血痕中Hb和血清蛋白抗原与相应的沉淀素抗体发生特异性结合 在一定的条件下出现白色沉淀 用已知的抗人Hb血清或抗人血清与待测血痕浸出液做沉淀反应 阳性结果为人血 阴性结果不是人血 方法 取待测血痕0 5cm2 剪碎 试管内 0 5mlNS 室温下浸泡2h 离心 取上清液作抗原液 将抗人血清或者抗人Hb血清 置毛细沉淀管下层 然后将血痕浸出液叠加在抗血清上 室温下观察30min 出现白色沉淀环为阳性 60 Ab Ag 环状沉淀示意图 沉淀管内径1 5 2mm60min内出现沉淀环为阳性60min不出现沉淀环为阴性 操作步骤 61 62 注意事项 陈旧 水洗血痕 浸泡时间不够 抗血清效价不够 会出现假阴性结果 应设置已知人血阳性对照 与动物血出现交叉反应 会出现假阳性结果 应设置已知动物血痕对照 检测灵敏度为1 1万 1 5万稀释血痕 采用单克隆抗体 酶联免疫吸附试验 ELISA 灵敏度达64万倍稀释 利用DNA序列的种属特异性 以PCR DNA分析作生物学检材的种属鉴定 无论从灵敏度或者特异性都有明显的进步 63 四 遗传标记的检测现场收集的血痕受外界影响是不可预知的 发案时间不可预测 现场检材的环境影响因素不可预测 是法医物证材料共同的特点 目前常规检测是PCR STR分型 只要能够提取到检材的模板DNA 就可以检测出检材的的DNA遗传标记 满足取材广泛 对超微量 腐败检材的鉴定要求 64 二 精斑检验精斑 seminalstains 常见于性犯罪案件 呈灰白色浆糊状不规则斑痕 成年男子一次射精量2 5ml 精子含量1 1 5亿 ml 精子细胞蝌蚪状 分头 颈和尾三部分 长50 60 m 65 一 预试验目的 筛选精斑 常规酸性磷酸酶试验 原理 精液中含大量的酸性磷酸酶 可以分解磷酸苯二钠 产生奈酚 奈酚经过铁氰化钾氧化后与氨基安替吡林结合 生成红色的醌类化合物 特点 灵敏度高 意义在阴性结果 部分内脏浸液 鼻涕 唾液 男性尿液呈弱阳性 66 二 确证试验1 精子检出法2 抗人精血清沉淀反应灵敏度2000 4000倍稀释精液 3 P30检测精液中具有前列腺特异性抗原 prostatespecificantigen 或者称 精浆蛋白 seminoprotein sm 属于一种糖蛋白 PI约6 9 MW30 000 简称P30 精液P30平均含量2mg ml P30具有高度特异性 用抗P30单克隆抗体 以沉淀试验 酶联免疫吸附试验 ELISA 检测 阳性为精斑 67 三 精斑的遗传标记检测1 ABO血型测定 精液含丰富的可溶性ABH物质 采用吸收 抑制法测定 2 DNA遗传标记 采用PCR STR分型 3 混合斑 混合DNA 女性成分对精液个体识别有干扰 目前采用二次裂解法或称差异裂解法 精子细胞膜 二硫交联结构 稳定 将斑迹浸出细胞 先SDS和PK处理 再用还原剂二硫苏糖醇 DTT SDS PK裂解精子细胞 获得精子DNA 68 三 其他生物学检材的个人识别鉴定个体识别鉴定 目前的关键的问题在生物材料的DNA提取 只要能够从材料中提取到有效量的DNA 就可以直接运用PCR STR标准分型方法检测 种属鉴别 PCR的引物设计就已具有人特异性 一般动物的材料是没有PCR扩增产物的 值得一提的是 高度腐败 陈旧 洗涤或雨淋血痕 极其微量的物证 没有细胞核的检材 可以采用mtDNA序列多态性分析技术 后者的灵敏度比STR分析高10倍 69 70 71 一 概述应用医学 遗传学的理论与技术 通过对人类遗传标记的检测和分析 判定父母和孩子是否亲生关系的法医学鉴定叫作亲权鉴定 或称亲子鉴定 多数亲权纠纷 disputedparentage 中 母子关系是确定的 要求通过鉴定证实被鉴定父亲 allegedfather AF 与孩子 child C 之间是否亲生关系 因此叫作父权鉴定 paternitytesting 72 在一些特殊情况下 如小孩上户口 移民等 有时需要鉴定母子间是否亲生关系 此类鉴定称为母权鉴定 maternitytesting 有些情况下 如怀疑医院调错婴儿 拐卖儿童的认领等 夫妻双方与孩子的关系皆不明确 此时需要鉴定这一对夫妻与孩子是否具有亲生关系 此类鉴定称为双亲皆疑亲子鉴定 73 亲子鉴定是法医物证学的主要任务之一 它是通过人类遗传标记的检测 按照人类遗传规律对遗传标记检测结果进行分析和判断进行的 由于高度多态性DNA标记的运用 目前的鉴定已不再仅限于父子或母子关系的鉴定 有关兄弟 姐妹 叔侄 祖孙等关系的鉴定亦能有效解决 因此 根据目前的鉴定业务所涉及的内容 使用更广义的 血缘关系鉴定 应更为合适 74 目前 国内外各亲权鉴定机构几乎都采用PCR STR分型技术 欧洲少数实验室联合应用STR和小卫星VNTR标记系统 在鉴定技术上 目前国内实验室和国外是处于同一水平 75 案由 离婚案件上升 涉及孩子的抚养纠纷 婚姻外性关系出现率上升 丈夫怀疑孩子不是自己亲生的 私生子 医院调错婴儿 血型测定错误 失散亲人的认亲 遗产继承纠纷 涉外婚姻及其子女的移民 超计划的生育 违纪案件强奸致孕 诱拐 个体识别 人工受精 76 王书德 1961年11月20日出生 福建省福清市三山乡人 妻子陈珠云 1964年8月25日出生 汉族 孩子王升鹏 1987年8月11日出生 黄石市五医院 因B O A血型不符 疑心不是自己亲生 1 张晓东 1987年8月10日出生 05 389鉴定排除父子关系 2 王升鹏 1987年8月11日出生 05 395号鉴定否定父子关系 3 秦炜 1987年8月10日出生 05 406号鉴定认定父子关系 案例 77 案例 某遗产纠纷案 78 79 二 基本原理原则 母子关系确定前提下 比对母子的基因型 可以在孩子的两个基因中找到来自生父的基因 obligatorygene OG 1在肯定C的某个等位基因是来自BF 而AF不具有这个等位基因 可以排除AF是C的BF 2在肯定C的某些基因是来自BF 而AF也具有这些基因 则不能排除他是C的BF 这时可以计算 如果认定AF是C的BF 理论上的 把握度 有多大 80 TH01基因座分型检测结果 81 表10 1A B二等位基因系统排除和不排除亲权的组合格局 82 三 排除父子亲生关系1非父排除率 probabilityofexclusion PE 是只通过某一遗传标记系统的检测 不是孩子生父的男子被排除亲生关系的概率 计算原理是考虑到M C表型和理论上能够被排除亲生关系男子所有的表型组合 然后计算每一组合的相对机会 总机会即该遗传标记的PE 是评估某GM系统在亲子鉴定中应用效能的指标 与具体的案件无关 在共显性多等位基因系统 如STR座位 PE pi 1 pi 2 pipj 2 3pi 3pj 4 83 检测多个遗传标记的排除无关男子的累进机会叫作累计非父排除率 cumulativeprobabilityofexclusion CPE 1 1 PE1 1 PE2 1 PE3 1 PEk 1 1 PEk 前提条件 所有检测的遗传标记系统之间没有遗传连锁关系 独立遗传 CPE是评估一个亲子鉴定实验室鉴别非亲生父亲能力的客观标准 84 基因座PECPETPOX0 3020 302D3S13580 5100 6580FGA0 6350 87516D5S8180 6830 960427CSF1PO0 4130 9767704D7S8200 4450 98710757D8S11790 6850 995938885TH010 3260 997262808vWA0 5400 998740892D13S3170 5930 999487543D16S5390 4090 999697137D18S510 6670 999899146D21S110 6770 999966415 表10 3汉族人群13个STR基因座的PE和CCE值 85 2否定父权的原则 血型是基因表达产物水平的遗传标记 基因突变或者基因表达异常 编码基因的突变率大约在10 4 10 5 故要求必须是2个或者2个以上的血型不符合遗传规律时才可排除父子关系 STR基因座属于高度变异 一般STR突变率大约在0 1 0 2 目前比较一致的意见是 检测15个常用STR基因座 其中有3个或3个以上的STR基因座不符合遗传规律 才能够作出排除亲生关系的结论 86 87 四 认定父子关系1亲权指数 1 概念 PaternityIndex PI 在观察分析AF M C表型 不排除AF是BF时 AF提供OG成为C的BF的机会X 随机男人提供OG成为C的BF的机会Y PI X Y PI是两种条件概率 和 的比值 在统计学理论上称为似然率 likelihoodratio LR 88 计算举例 如 亲子鉴定中 D3S1358基因座检测结果如下 AF 14 17M 15 16C 14 15 设汉族群体中等位基因14的频率为0 1 15的频率为0 2 则 PI值为 89 计算举例 如 亲子鉴定中 D3S1358基因座检测结果如下 AF 15 17M 15 16C 15 16 设汉族群体中等位基因15的频率为0 1 16的频率为0 2 则 PI值为 90 计算举例 如 亲子鉴定中 D3S1358基因座检测结果如下 AF 15 16M 15 16C 15 16 设汉族群体中等位基因15的频率为0 1 16的频率为0 2 则 PI值为 91 2 累计PI combinedpaternityindex CPI 如果AF是BF 则无论检测多少个遗传标记都不能排除亲生关系 则CPI等于每一个PI的乘积 即 CPI PEi 92 基因座MCOG f AFXYPITH017 107 99 0 1250 9 110 5 0 50 125 0 54 0vWA17 1716 1716 0 2500 14 160 5 10 25 12 0D5S8187 96 96 0 1000 6 61 0 50 1 0 510 0 PI值计算实例 CPI 4 0 2 0 10 0 80 93 需要强调的是 亲子鉴定中PI值的计算是基于M C AF三人的遗传标记检测结果符合遗传规律这一前提 鉴定中使用的全套遗传标记系统的效能 即多个遗传标记系统的累计非父排除率 CCE 必须足够高 才是用PI进行统计决策的前提 不管系统效能 仅靠PI值高低单一指标进行统计决策是不可靠的 那么 CCE究竟定为多高合适呢 理论上说 越高越好 但不切实际 教科书上提的是 99 95 而 中华人民共和国公共安全行业标准 亲子鉴定标准 送审稿 中提到的是 99 99 在满足CCE 99 99 的前提下 AF的累计父权指数大于10000时 可以认定AF的父权 即可以断定他是小孩的生物学父亲 94 2父权相对机会 relativechanceofpaternity RCP 1 PI是实数 通常将PI换算成相对值 RCP RCP PI PI 1 例如 某亲子鉴定案总的父权指数 PI总 计算值为2497 在前概率相同的条件下 则 95 RCP值是一个概率含义 从理论上而言 永远达不到100 实际上RCP值是鉴定人对判定亲生父子关系的一种 把握度 目前学术界比较一致的意见是RCP 99 99 作为判定亲生关系的界限 即在CCE在 99 99 的前提下 我 鉴定人有99 99 的 把握 认为 AF100 是C的BF 96 GMAFMCPITH019 109 109 101 8904vWA17 1716 1816 173 3113FES11 1311 1111 132 6882D19S40012 1212 1312 132 0263D19S25311 1212 1311 135 2521D8S117913 1814 1515 1812 6263D21S14097 710 117 102 5157D21S205517 2018 2617