免疫萤光染色.docx

免疫荧光细胞化学染色方法一、标本制作可制作涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片，经适当固定或不固定，作免疫荧光染色用。二、荧光抗体染色方法（一）直接法1染色 切片经固定后，滴加经稀释至染色效价如1：8或1：16的荧光抗体（如兔抗人-球蛋白荧光抗体或兔抗人IgG或IgA荧光抗体等），在室温或37染色30min，切片置入能保持潮湿的染色盒内，防止干燥。2洗片 倾去存留的荧光抗体，将切片浸入pH7.4或pH7.2PBS中洗两次，搅拌，每次5min，再用蒸馏水洗1min，除去盐结晶。3用50%缓冲（0.5mol/L碳酸盐缓冲液pH9.09.5）甘油封固、镜检4对照染色正常免荧光血清染色，如上法处理切片，结果应为阴性。染色抑制试验（一步法）：将荧光抗体和未标记的抗体球蛋白或血清（相同）等量混合，如上法处理切片。结果应为阴性。为证明此种染色抑制不是由于荧光抗体被稀释所致，可用盐水代替未标记抗血清，染色结果应为阳性。此法结果较二步法稳定。类属抗原染色试验，前面已作叙述。直接法比较简单，适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白质抗原如肾、皮肤的检查和研究。此法每种荧光抗体只能检查一种相应的抗原，特异性高而敏感性较低。（二）间接法（1）切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的湿度，37作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗两次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液体。（2）再滴加间接荧光抗体（如兔抗人-球蛋白荧光抗体等），同上步骤，染色30min，37，缓冲盐水洗两次10min，搅拌，缓冲甘油封固，镜检。对照染色：抗体对照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法进行染色，结果应为阴性。抗原对照：即类属抗原染色，亦应为阴性。阳性对照。间接法中上述方法称双层法（Double Layer Method）。另一种称夹心法，即用未标记的特异性抗原加在切片上先与组织中之相应抗体结合，再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上，而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在，方法步骤如下：切片或涂片固定后，置于染色湿盒内。滴加未标记的特异性抗原作用切片于37，30min。缓冲盐水洗2次，每次5min，吹干。滴加特异性荧光抗体再用切片于37，30min。如水洗。缓冲甘油封固，镜检。间接法只需制备一种荧光抗体可以检出多种抗原，敏感性较高，操作方法较易掌握，而且能解决一些不易制备动物免疫血清的病原体（如麻疹）等的研究和检查，所以已被广泛应用于自身抗体和感染病人血清的试验。（三）补体法1材料（1）免疫血清60灭活20min，用Kolmers 盐水作2倍稀释成1：2，1：4，1：8。补体用1：10稀释的新鲜豚鼠血清，抗补体荧光抗体等，按下述的补体法染色。免疫血清补体结合的效价，如为1：32则免疫血清应作1：8稀释。（2）补体用新鲜豚鼠血清一般作1：10稀释或按补体结合反应试管法所测定的结果，按2单位的比例，用Kolmers盐水稀释备用。Kolmers盐水配法：即在pH7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲盐水中，溶解MgSO4的含量为0.01%浓度。（3）抗补体荧光抗体：在免疫血清效价为1：4，补体为2单位的条件下，用补体染色法测定免疫豚鼠球蛋白荧光抗体的染色效价，然后按染色效价1：4的浓度用Kolmers盐水稀释备用。2方法步骤（1）涂片或切片固定。（2）吸取经适当稀释之免疫血清及补体之等量混合液（此时免疫血清及补体又都稀释一倍）滴于切片上，37作用30min，置于保持一定湿度的染色盒内。（3）用缓冲盐水洗2次，搅拌，每次5min，吸干标本周围水液。（4）滴加经过适当稀释之抗补体荧光抗体30min，37，水洗同（3）。（5）蒸馏水洗1min，缓冲甘油封固。3对照染色（1）抗原对照。（2）抗血清对照：用正常兔血清代替免疫血清。（3）灭活补体对照：将补体经5630min处理后，按补体同样比例稀释，与免疫血清等量混合后，进行补体法染色。本法之荧光抗体不受免疫血清的动物种属的限制，因而一种荧光抗体可作更广泛的应用，敏感性亦较间接法高，效价低的免疫血清亦可应用，节省免疫血清，尤其是对检查形态小的如立克氏体、病毒颗粒等或浓度较低的抗原物质时甚为理想。（四）膜抗原荧光抗体染色法本法应用直接法或间接法的原理和步骤，可对活细胞在试管内进行染色，常用于T和B细胞、细胞培养物、瘤细胞抗原和受体等的检查和研究，阳性荧光主要在细胞膜上。FACS即采用此法原理。（五）双重染色法在同一标本上有两个抗原需要同时显示（如A抗原和B抗原），A抗原的抗体用FITC标记，B抗原的抗体用罗达明标记，可采用以下染色方法：1一步法双染色 先将两种标记抗体按适当比例混合（A+B），按直接法进行染色。2二步法双染色 先用RB200标记的B抗体染色，不必洗去，再用FITC标记的A抗体染色，按间接法进行。结果：A抗原阳性荧光呈现绿色，B抗原阳性呈现桔红色荧光。（六）荧光抗体再染色法若切片或其他标本经某种荧光抗体染色后，未获得阳性结果，而又疑有另外的病原体存在时，可用相应的荧光抗体再染色。有时存档蜡块不能再用以切片，也可用存档的HE染色标本，褪去盖片和颜色，再作免疫荧光或其它免疫细胞化学的染色。三、荧光抗原染色法某些抗原可以用荧光素标记，制成荧光抗原，标记荧光素的方法与制备荧光抗体方法相同。用荧光抗原可以直接检查细胞或组织内的相应抗体，特异性较好，敏感性较差。染色方法同荧光抗体染色的直接法。由于多数抗原难以提纯或量少不昂贵，一般很少采用此法。细胞膜上的免疫荧光检测法关键词：细胞膜免疫荧光2012-02-17 10:22来源：丁香园点击次数：537间接标记法1. 制备单细胞悬液；2. 细胞计数，取出 1106个细胞于试管中；3. 用台盼蓝染色计活细胞数，要求活细胞数 9095%；4. 在试管中加入一抗， （剂量按照说明书的要求） ，孵30育60 分钟；5. PBS 洗涤 12 次，1500rpm，离心 3 分钟，弃上清；6.加入二抗，孵育 2030 分钟；7. PBS 洗一次，1500rpm，离心 3 分钟，弃上清;8. 加 300 l PBS，上机检测( 若不能及时