基因工程PCR课件.ppt

第五章聚合酶链式反应 PCR 基因扩增 geneamplification 1 环境诱发扩增在环境因子的诱发下 某些基因产生明显的扩增 如氨甲喋呤诱发二氢叶酸还原酶基因扩增 2 基因的程序性扩增在发育的某个阶段 某些基因的大量扩增 如非洲爪蟾卵子形成过程中rRNA基因的扩增 3 基因组进化扩增生物进化过程中基因组中某些基因的拷贝数增加 结果相关的基因聚集成簇 4 基因工程扩增载体携带目的基因在寄主细胞中大量复制 5 PCR扩增应用聚合酶链式反应 PolymeraseChainReaction PCR 技术 在体外特异性地扩增某个基因 5 1 1 1971年Khorana提出体外人工复制DNA的设想 由于引物和DNA聚合酶及DNA测序技术都没有解决 设想未能实现 2 1985年Cetus公司的科学家K B Mullis发明了PCR 使这一设想变成现实 PCR的发明 Mullis由此获得1993年诺贝尔化学奖 3 TaqDNA聚合酶1986年H A Erilish从嗜热水生菌分离出耐高温的TaqDNA聚合酶 代替Klenow片段 PCR技术才进入实用阶段 1988年R K Saiki把TaqDNA聚合酶用到PCR反应中 使PCR自动循环仪成为可能 4 PCR仪1988年Cetus公司发明自动热循环仪 5 2PCR扩增原理PCR 是在模板DNA 引物和dNTPS存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应 其扩增原理是以半保留复制的形式进行 在体外进行DNA的变性 退火和引物延伸三个阶段的循环反应 PolymeraseChainReaction PCR 根据已知的DNA核苷酸序列从两个5 端合成两条16 24bp的引物 要进行PCR反应 必须对目的基因片段两侧的序列了解清楚 至少要预先知道足够合成一对引物的靶DNA序列 就可通过PCR反应 直接从染色体DNA或cDNA上高效快速地扩增出目的基因片段 5 3PCR技术特点 pg ng的DNA模板分子即可 1 特异性强 错配率约万分之一 2 104 扩增产物的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性 2 敏感性高 4 简便 扩增产物直接作序列分析和分子克隆 不必按常规方法先克隆再做序列分析 3 快速 整个PCR过程约4hr完成 样品处理约1hr PCR2hr 产物凝胶电泳分析约1hr Clark发现用TaqDNA聚合酶得到的PCR反应产物不是平末端 而是有一个突出A碱基末端的双链DNA分子 根据这一发现设计了克隆PCR产物的T 载体 利用Taqpolymerase的特性 利用restrictionenzyme 5 可扩增RNAorcDNA 有些外显子分散在一段很长的DNA中 难于将整段DNA大分子扩增和做序列分析 若以mRNA作为模板 可将外显子集中 用PCR一次完成对某些外显子的扩增并进行序列分析 RT PCR 先用逆转录酶将mRNA合成cDNA 再以cDNA为模板进行扩增 模板可以是cDNA的第一条链 也可以是总DNA 对大批量PCR产物分析不影响 但用于克隆的DNA 必须检测克隆产物的DNA序列 6 对材料 模板 质量要求低 微量 粗制及部分降解的DNA材料都可作为起始材料 7 有一定程度单核苷酸错误掺入 5 4PCR反应体系1 TaqDNA聚合酶 热稳定性 TaqDNA聚合酶的最大特点是热稳定性 耐高温 非常适合PCR过程的反复高温变性要求 最适温度高 最适温度 75 80 延伸速度 35 150nt s 酶分子 最长延伸长度 6 7kb Taq酶的缺点 具有5 3 聚合酶活性和5 3 外切酶活性 但没有3 5 外切酶活性 因此不能修正错误的碱基配对 合成超过600bp长度的DNA就有可能出现错配 用于克隆基因时必须测序 其它耐热的DNA聚合酶 TthDNA聚合酶 无3 5 DNA外切酶活性 但高温下能逆转录cDNA 又能扩增DNA VENTDNA聚合酶 有3 5 外切酶活性 能够校正碱基的错配 能耐受100 高温 PfuDNAPolymerase有3 5 的外切酶活性 5 3 外切酶活性 是目前已发现的所有耐高温DNA聚合酶中出错率最低的 但PCR产物为平端 TaqPlusDNAPolymerase是Taq和PfuDNA聚合酶的混合物 Taq的PCR产物3 端往往带有一个A 纯度PCR对模板要求不高 但不能存在蛋白酶 核酸酶 尿素 SDS EDTA等试剂 用量一般50 l反应体系中50ng即可 模板太多 会令扩增失败 2 模板 template 3 引物 primer 终浓度0 5 mol L 4 dNTPs浓度 一般反应体系中dNTP混合浓度为200 mol L 浓度过高会抑制TaqDNA聚合酶的活性并增加错配率 5 Mg2 浓度 2 0mmol LTaqDNA聚合酶对金属离子的性质和浓度较敏感 特别是Mg2 在4种脱氧核苷酸dNTP的总浓度 0 2mmol L时 浓度为2 0mmol L的MgCl2能最大程度地激活TaqDNA聚合酶的活性 过高则对酶活性表现出一定的抑制作用 5 5PCR反应条件1 变性 94 95 1min 预变性5 10min 2 引物的退火 Tm G C 4 A T 2 实际复性温度低于Tm值5 当引物中 G C 含量低于50 时 复性温度低于55 提高退火温度 可提高引物与模板结合的特异性 时间30 60s 3 延伸温度和时间 一般72 1min 延伸时间过长 非特异扩增带出现 但最后一步可延长4 10min 使反应完全 产量高 4 循环数 25 40周期 次数少 产量不够 次数过多 反应停止 呈平台效应 5 6PCR引物设计原则a 长度15 30bp Tm55 75 b G C占50 60 避免单一碱基的连续排列 一般两端G C含量近似 c 引物3 端必须与模板DNA互补 d 一对引物间连续互补碱基小于4个 e 引物本身应避免有回文序列 410 1 05 106 百万 420 1 1 1012 万亿 引物的长度 一般引物设计为长15 30bp 即1 1 1012bp的基因组中有一次完全与20个核苷酸的序列相同的机会 6 12bp为随机引物 在基因组中与随机引物完全相同的序列可能有多个 因而扩增时可以产生多个片段 因此多用于生物的分类学研究 引物的碱基序列 3 端必须与模板正确配对 5 端可以不配对 5 端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序 RNA聚合酶识别序列 突变位点或生物素标记等 方便与以后操作 引物的碱基组成 提高G C含量 以提高引物与模板的结合力 避免连续相同碱基排列或内部回文序列 避免形成引物二聚体 dimer 两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补 简并引物 根据蛋白质的氨基酸序列设计一组混合引物来合成相应的基因 例如 HisPheProPheMetLys5 CAYTTYCCNTTYATGAAR 3 其中 Y 嘧啶 UC R 嘌呤 AG N 任意碱基该序列具有2 2 4 2 2 64倍简并性 其中之一必是正确的 组苯丙脯甲硫赖 嵌套引物 nestedprimers 设计多组引物 结合位点依次位于前一组引物之间 利用第一轮PCR扩增产物作为第二轮PCR扩增的起始材料 进行二次PCR扩增 这样能够使靶DNA序列得到有效的选择性扩增 增加扩增产物的特异性 引物设计现在多用专业软件如Primer5 0等 5 7PCR技术的扩展 技术关键 把线性DNA模板转变成环形分子 使引物的外侧序列 转变 成内侧序列 1 反向PCR 扩增两个引物外侧的未知序列 传统PCR只扩增两个引物之间的已知序列 技术关键 两个引物的浓度相差100倍 低浓度的引物 限制引物 首先耗尽 随后只有高浓度的引物 继续合成单链DNA 最后产物中99 是单链DNA 可用于Sanger法测序 2 不对称PCR 用于扩增单链DNA 单链DNA更适于测序 技术关键 利用反转录酶 把RNA反转录成cDNA 再以cDNA为模板进行PCR扩增 3 反转录PCR RT PCR 扩增RNA模板 如mRNA或RNA病毒 Temin H 发现反转录酶 1975诺贝尔奖 5 8PCR技术的应用 1 扩增某一段DNA 基因组克隆 突变基因同野生型基因的比较 通常先构建突变体的基因文库 再应用杂交筛选等一系列烦琐的步骤 分离到所需的克隆 然后对突变基因测序并同野生型进行分析比较 利用PCR则可根据野生型基因的序列 设计一对合适的引物 从基因组 突变体 中直接扩增突变基因DNA产物 供测序使用 技术关键 利用引物的5 端序列不要求与模板严格配对 设计引物时引入突变序列 2 基因的体外诱变在基因的某处引入核苷酸突变 缺失 重复 插入 替换等 用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作为引物 启动单链DNA分子进行复制 随后这条引物便成为新合成DNA子链的一个