普鲁兰多糖的分离纯化及结构鉴定.doc

普鲁兰多糖的分离纯化及结构鉴定作者：曹海石 添加日期：2011-08-20 23:21:02 浏览：270次 普鲁兰多糖是由茁芽短梗霉(A u reobasid ium p u llu lans) 分泌的胞外多糖 1 , 它具有无毒害、粘结性强和成膜性好等优良特性, 可作为食品、医药方面的粘合剂和包装材料. 此外, 也广泛应用于水果蔬菜保鲜、种子保护、化妆品和卷烟生产等方面, 是一种新型的多功能生物产品, 有较好的应用前景 2, 3 . 目前, 普鲁兰多糖的应用国外已申请了多项专利, 我们实验室经紫外诱变筛选出一株高产普鲁兰多糖的菌株(A u reobasid ium p u llu lans JB518) 4 , 对其产生的多糖进行了分离纯化, 该纯化方法简便、回收率高. 同时通过薄层层析、红外光谱及核磁共振等方法对其结构进行了鉴定, 证实了它的基本结构单位为麦芽三糖, 每个麦芽三糖之间由A(16) 糖苷键相连, 这为该变异菌株的应用提供了理论依据. DEA E2纤维素为W hatm an 产品, Sephadex G2100 为Pharm acia 产品, 普鲁兰多糖 (Pu llu lan) 标准品、 麦芽三糖和普鲁兰酶(EC. 3. 2. 1. 41) 为Sigm a 产品, 其它化学试剂均为国德国B ruker 1FS66V 真空型红外光谱仪. 美国V arian 公司U n ity 400 NMR 仪.将本实验室经紫外诱变获得的茁芽短梗霉(JB518) , 在含2% 蔗糖, 012% 的酵母浸膏, 012% KH2PO 4, 0. 1%MgSO 47H2O , 0. 1%NaOH 和0. 04% (NH4)2 SO4 的液体培养基中培养, 在250 mL 锥形瓶中加入50 mL 培养基, 用接种环移菌3 次, 于28 发酵96 h, 发酵液in 的转速下离心30 m in, 去沉淀, 上清液加入2 倍无水乙醇, 搅拌、放置过夜,使普鲁兰多糖充分沉淀. 沉淀液以4 500 r/min 离心30 min, 得普鲁兰多糖沉淀, 沉淀依次用丙酮、乙醚洗涤, P1O5干燥, 即得普鲁兰多糖粗品, 从50 mL 发酵液中可得其粗品115 g.1. 3多糖及蛋白质含量的测定 采用改良的苯酚2硫酸法 5 . 取待测溶液012 mL , 加入浓度为50 gL 的苯酚溶液014mL , 混合均匀后迅速加入2 mL 浓H2SO 4, 振荡摇匀, 于室温放置30 m in, 用721 分光光度计在490 nm 处测定光吸收值.采用Low ry 法 6 , 以牛血清白蛋白为标准蛋白测定蛋白质含量.1. 4核磁共振光谱测定及薄层层析1H NMR 频率399195MHz, 90 脉冲25 Ls, 脉冲延迟时间316 s, 累加128 次, 溶剂DM SO 2d6, 参考标准: DDM SO = 2150, 样品浓度5% (质量体积分数) , 控温误差0. 1 .13C NMR 频率100157MHz, 90 脉冲14 Ls, 脉冲间隔115 Ls, 宽带噪音去偶, 累加3 000次, 溶剂DM SO 2d6, 参考标准: DDM SO = 39160, 样品质量体积分数12% , 控温误差0. 1 .薄层层析(TLC) 采用硅胶板法 7 . 在10 g 硅胶G260 干粉中加入0102mo lL 的乙酸钠溶液25 mL , 搅拌均匀, 平铺在玻璃板上, 自然晾干后, 于120 加热活化30 m in, 制成硅胶板.1. 5刚果红实验Fig. 1Curve eluted on DEAE-cellulosecolumn by waterFig. 2Curve eluted on DEAE-cellulosecolumn by Na2B4O7 solution参照文献 8 方法. 刚果红溶液浓度为21510- 5 mo lL , 普鲁兰多糖溶液质量浓度为10 m gmL. 将N aOH 依次配成不同浓度(012 110 mo lL ) , 将普鲁兰多糖溶液和刚果红溶液混合(体积比11) , 然后加入与混合液等体积的不同浓度的N aOH, 静置15 m in 后, 用721 分光光度计依次测定混合液在不同浓度的N aOH 溶液中最大吸收波长的变化(以刚果红溶液为对照).2结果与讨论2. 1普鲁兰多糖的纯化2. 1. 1Savage 法参照文献9 方法. 将610 g 普鲁兰多糖粗品稀释成115% 的水溶液400mL , 加入100 mL 氯仿丁醇混合液(体积比41) , 充分振荡使蛋白质析出, 以2 000 rm in离心30 m in, 除去沉淀, 将上清液再用此方法处理, 重复7 次. 最后得到脱去蛋白的上清液.将该上清液逆向流水透析3 d, 将其减压浓缩至200 mL 左右, 加入2 倍体积无水乙醇, 充分搅拌, 放置过夜, 使普鲁兰多糖沉淀, 沉淀液以4 500 rm in 离心30 m in, 将沉淀用丙酮、乙醚依次洗涤, P2O 5 干燥, 得普鲁兰多糖粉末518 g.2. 1. 2DEA E2纤维素柱层析将经Savage 法除蛋白的普鲁兰多糖粉末溶于10 mL 蒸馏水中, 进行DEA E2纤维素(硼酸型) 柱层析(313 cm 40 cm ) , 洗脱速度为1 mLm in. 首先用蒸馏水洗脱, 分部收集(每管5mL ) , 用改良的苯酚2硫酸法比色鉴定多糖部分, 洗脱曲线如图1所示. 收集多糖峰, 减压浓缩、透析、冷冻干燥得412 g 样品1. 该层析柱用0112mo lL 硼砂洗脱, 洗脱曲线如图2 所示. 同样收集多糖峰, 浓缩、透析、冷冻干燥得115 g 样品2.0 3 7 1 高等学校化学学报Vo l. 20 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.2. 1. 3Sephadex G2100 柱层析分别取样品1 和样品2 溶液进行Sephadex G2100 柱层析(1 cm 100 cm ) , 进样量为015 mL , 样品质量分数为017% , 用蒸馏水进行洗脱, 洗脱速度为4 mLh , 用改良的苯酚2硫酸法比色鉴定多糖部分, 洗脱曲线如图3 和图4 所示. 样品1和样品2 各有一个洗脱峰, 收集洗脱峰后分别冷冻干燥得白色粉末410 g P1和112 g P2.Fig. 3Gel f iltration of sample 1 on SephadexG-100 columnFig. 4Gel f iltration of sample 2 on SephadexG-100 column经过Savage 法、DEA E2纤维素柱层析及Sephadex G2100 柱层析将发酵得到的普鲁兰多糖进行纯化, 获得了纯品普鲁兰多糖, 总收率6617%.2. 2结构研究2. 2. 1薄层层析取普鲁兰酶1 m g (含4 个酶活力单位) 溶于115 mL 柠檬酸2磷酸二氢钠缓冲液中(pH 510, 0103 mo lL ) , 将酶液均匀分为3 份, 分别加入10 m g 普鲁兰多糖标准品、P1 及P2, 然后在37 培养箱中保温酶解2 h, 将酶解液以标准麦芽三糖为对照在G260 硅胶薄板展层, 展层体系为乙腈水(体积比851) , 以硫酸甲醇(体积比13) 为显色剂, 展层完毕后将显色剂喷于硅胶板上, 在105 加热显色. 由于普鲁兰酶可特异地水解多糖分子中的A(16) 糖苷键, 而对其它糖苷键并没有作用, 所以普鲁兰多糖在普鲁兰酶的作用下, 水解为麦芽三糖, 而其它多糖却无此结果. 从薄层层析图谱中可见, 普鲁兰多糖标准品和P1 被普鲁兰酶水解后都形成了麦芽三糖. 说明P1 是由A(16) 糖苷键结合的麦芽三糖所组成, 即是普鲁兰多糖. P2 在酶的作用下没有发生降解, 依然是多糖大分子, 停留在原点位置, 从而证明P2 不是普鲁兰多糖而是其它多糖.2. 2. 2红外光谱P1, P2 及标准普鲁兰多糖的红外光谱分析表明, 多糖分子的特征峰为1 200 1 030 cm - 1处的MC= O 峰和930 900 cm - 1处的D 2吡喃葡萄糖环振动峰 10, 11 . 普鲁兰多糖标准品与P1 谱中出现多糖的特征峰, 其两条谱线几乎完全相同, 但与P2 谱线相差较大,说明P1 为普鲁兰多糖, P2 为其它糖分子.2. 2. 3核磁共振将纯品普鲁兰多糖P1 经核磁共振光谱分析, 其质子峰位移出现在D 3. 1 5. 4 之间, 由于OH 效应致使谱峰略增宽. 环侧基CH2OH 的特征峰出现在D 60. 34, 60. 58处, 表明结构单元中含2 个CH2OH 基团. 由于多糖相连, 其糖苷键相连的C1 峰移向低场, 出现在D 98174, 100156 和101129 处, 证明结构单元含有不等同的C1, 其它各峰出现在D67. 03 80. 61处. 由1H 和13C NMR 特征峰可知, 该样品与普鲁兰多糖的结构一致.2. 2. 4刚果红实验刚果红(Congo red) 是一种染料, 分子式为C32H22N 6O 6S2N a2, 它可与具有多股螺旋构象的多糖形成配合物, 配合物的最大吸收波长同刚果红相比发生红移. 在一定的N aOH 浓度范围内, 配合物出现亚稳区 12 . 普鲁兰多糖在刚果红实验中, 与刚果红配合物1 3 7 1 No. 11 曹海石等: 普鲁兰多糖的分离纯化及结构鉴定 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.的最大吸收波长虽然也发生红移, 但未出现亚稳区, 表明普鲁兰多糖分子并不存在多股螺旋构象. 这是由于普鲁兰多糖分子是由重复单位麦芽三糖经A(16) 糖苷键连接而形成的线性分子, 在该多糖的糖链中存在大量的(33% )A(16) 糖苷键, 由于A(16) 糖苷键存在一定的旋转自由度, 所以缺乏刚性, 在水