（动物遗传育种与繁殖专业论文）牛子宫内膜共培养体系对小鼠早期胚胎体外发育的影响.pdf

一 警 p 警 英文缩略词对照表 a r ta s s i s t e dr e p r o d u c t i v et e c h n o l o g i e s 辅助生殖技术 d m e m h a mf 1 2d u l b e c c o sm o d i f i e de a g l e sm e d i u m n u t r i e n tm i x t u r e f 1 2 h a m 1 1e a g l e 改良培养液与f 1 2 h a m 各半的混合培养液 d 她m 1 9 9 e b s s d n a s ei e d t a d m s 0 e r e s c s f e e c g n r h h c g h e p e s i c m i c s i i f i g f i l i g f b p i i v f e t p c d p m s g s c m t g f q d u l b e c c o sm o d i f i e de a g l e sm e d i u m d m e m l o wg l u c o s e m e d i u m1 9 9 d e o x y r i b o n u c l e a s ei 脱氧核糖核酸酶i e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 d i m e t h y ls u l f o x i d e 二甲基亚砜 e s t r o g e nr e c e p t o r 雌激素受体 e n d o m e t r i a ls t r u m a lc e l l s 子宫内膜间质细胞 f a l l o p i a nt u b ee p i t h e l i a lc e l l s 输卵管上皮细胞 g o n a d o t r o p h i nr e l e a s i n gh o r m o n e 促性腺激素释放激素 h u m a nc h o r i o n i cg o n a d o t r o p h i n 绒毛膜促性腺激素 n 2 h y d r o x y e t h y l p i p e r a z i n e n e t h a n e s u l p h o n i ca c i d 乙基 呱嚓乙硫磺酸 i n n e rc e l lm a s s 内细胞团 i n t r a c y t o p l a s m i cs p e r mi n j e c t i o n 卵胞浆内单精子注射 z m p l a n tf a i l u r e 种植失败 i n s u l i n l i k eg r o w t hf a c t o r 胰岛素样生长因子 i n t e r l e u k i n 白细胞介素 i n s u l i n l i k eg r o w t hf a c t o r b i n d i n gp r o t e i n i 类胰岛素生长 因子结合蛋白一i i nv i t r of e r t i l i z a t i o na n de m b r y ot r a n s f e r 体外受精一胚胎 移植 p r o g r a m e dc e l ld e a t h 细胞程序性死亡 p r e g n a n c ym a l es e r u mg o n a d o t r o p h i n 孕马血清促性腺激素 s e q u e n t i a lc u l t u r em e d i a 序贯培养液 t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r n 转化生长因子一a r m 一 j f 士 p b s f b s b s a c l l g i n i g f t f n a h c 0 3 p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e 磷酸缓冲盐溶液 f e t a lb o v i n es e r u m 胎牛血清 b o v i n es e r u ma l b u m i n 牛血清白蛋白 c o r p u sl u t e u m 黄体 l g l u t a m i n el 谷氨酰胺 i n s u l i n l i k eg r o w t hf a c t o r 胰岛素样生长因子 t r a n s f e r r i n 转铁蛋白 s o d i u mb i c a r b o n a t e 碳酸氢钠 l r f j j 论文独创性声明 本人郑重声明 所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的 成果 尽我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 学位论文中不包含其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果 也不包含为获得四川农业大学或其它教育机 构的学位或证书所使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意 研究生签名 i 长春确 如 俘厂月巧日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留 使用学位论文的规定 即 学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版 允许论文被查阅和借阅 可以 采用影印 缩印或扫描等复制手段保存 汇编学位论文 同意四川农业大学可以用不 同方式在不同媒体上发表 传播学位论文的全部或部分内容 研究生签名 导师签名 知口f 年厂月矽日 d 伽占年易月多汐日 摘要 本试验以雅安本地黄牛黄体期早期和中期的子宫内膜细胞和华西动物房昆明小 鼠早期胚胎为研究对象 对不同传代次数的子宫内膜细胞与鼠胚共培养进行了研究 同时结合共培养组及对照组体外培养资料 根据胚胎形态学进行评分 分析共培养组 与对照组间以及共培养组问各期胚胎的发育情况 分析了共培养对克服鼠胚发育阻滞 及鼠胚体外发育的影响 依此来推论共培养的作用机制 从而为体外受精牛胚与牛子 宫内膜细胞共培养的研究打下基础 并为提高体外受精一胚胎移植妊娠成功率的研究 提供可行性分析 结果表明 1 共培养组 原代 组1 早期传代 传3 代 组2 晚期传代 传7 代 组3 和早期传 代冷冻复苏 组4 的子宫内膜细胞单层1 和对照组 单一培养液 对小鼠2 细胞期胚胎 培养2 4 小时后 均有部分胚胎停滞于2 细胞期 持续观察2 4 小时 发现停滞胚胎 并不继续分裂 且各组异裂胚胎增加 对照组与共培养组相比 发生2 细胞期阻断 的胚胎数显著高 0 0 5 而共培养组间无明显不同 对照组和共培养组之间异裂 胚胎无差异 说明共培养能明显改善昆明小鼠胚胎的2 细胞期发育阻滞 2 共培养组中鼠胚的4 8 细胞期胚胎 桑堪胚 囊胚形成率明显高于对照组 p 0 0 5 共培养组中原代组 早期传代组和早期传代冷冻复苏组鼠胚的囊胚孵出率显著高于 对照组口 0 0 5 且早期传代组及其冷冻复苏组中桑葚胚 囊胚形成率及囊胚孵出 率极显著高于对照组口 o 0 1 共培养组间各期胚胎相比较 早期传代组 早期传 代冷冻复苏组 原代组和晚期传代组间除了早期传代组中囊胚孵出率极显著高于晚 期传代组 p o 0 1 外其余各期胚胎的形成率共培养组问无显著性差异但培养效果呈 现依次下降的趋势 说明共培养体系能有效的促进小鼠胚胎的体外发育 并且随着 子宫内膜细胞传代次数的增加细胞促进胚胎发育的作用有逐渐降低的趋势 其中早 期传代细胞共培养效果最佳 3 共培养组8 细胞期优质胚胎 a 类胚胎 率分别占6 2 0 7 7 1 4 3 6 0 7 1 6 9 7 0 而对照组为2 7 7 8 共培养组与对照组间有显著性差异口 0 0 5 共培养组间优质 胚胎率虽然差异不显著但早期传代组 早期传代冷冻复苏组 原代组和晚期传代组 间优质胚胎率也依次呈现逐渐下降的趋势 同时看到对照组劣质胚胎 b 类胚胎 形成 率明显高于共培养组 即单一培养液培养组 对照组 胚胎的碎片多于实验组 共培养 组 说明共培养体系能有效的促进小鼠胚胎的体外发育 改善胚胎质量 关键词 共培养 胚胎发育 牛子宫内膜细胞 早期传代 2 t h ee f f e c to f b o v i n ee n d o m c t r i a lc e l l so nm o u s ee a r l ye m b r y o n i c z h a n gs u 出 d i r e c t e db yp r o f z h e n g h o n g p e i c o l l e g eo f a n i m a ls c i e n c ea n dt e c h n o l o g y s i c h u a na g r i c u l t u r a l u n i v e r s i t y y a a n c h i n a 6 2 5 0 1 4 t h ec o c u l t u r eo fd i f f e r e n tg e n e r a t e de n d o m e t r i a lc e l l so fb o v i n ed u r i n ge a r l yt o m i d l u t e a lp h a s ea ty a a i ll o c a la b a t t o i r i n c l u d i n gt h ep r i m a r yc u l t u r ee n d o m e t r i a lc e l l s g r o u p t h ee a r l yp a s s a g e 3g e n e r a t i o n e n d o m e t r i a l c e l l sg r o u p t h el a t e p a s s a g e 7 g e n e r a t i o n e n d o m e t r i a lc e l l sg r o u pa n d t h ee a r l yp o s t c r y o t h a w e de n d o m e t r i a lc e h sg r o u p m o n o l a y e r a n dn l o u e m b r y o s c o l l e c t e da f t e rs u p e r o v u l a t i o n m o u s ed e v e l o p e db y a n i m a lh o u s eo fh u a x i w a sd e t e c t e db yg r a d e de m b r y o so nt h eb a s i so fm o r p h o l o g y t h e nt h em e d i u mc u l t u r ea l o n ew a st h ec o n t r o lg r o u p b a s e do nt h ed e t e c t i o no ft h e m o r p h o l o g yo fe m b r y o s t h ee f f e c t so fd i f f e r e n tp a s s a g ee n d o m c t r i a lc e l l so l io v e r c o m i n g t h ed e v e l o p m e n t a lb l o c ka n de m b r y o n i cd e v e l o p m e n to f m o u s ei nv i t r ow e r ea n a l y z e d s o w ec o u l dd e d u c et h em e c h a n i s mo f c o c u l t u r e t op r e p a r ef o rt h es t u d yo f b o v i n ea u t o l o g o u s e n d o m e t r i a lc e h sa n de m b r y o si nv i t r of e r t i l i z a t i o nc u c u l t u r c f u r t h e r l yt oi n c r e a s et h e p r e g n a n c yr a t e t h a tw i t hi nv i t r of e r t i l i z a t i o n e m b r y ot r a n s f e rf o rb o v i n ee m b r y o s d e v e l o p m e n t o na u t o l o g o u se n d o m e t r i a lm o n o l a y e rc e l l s i a f t e rc o c u l t u r ea n dm e d i u mc u l t u r ea l o n ef o r2 4 h s o m eo f t h em o u s ee m b r y o ss t o p p e d i nt w o c e l ls t a g e b u tt h en u m b e ro fe m b r y o st h a ts r o p e di nt w o c e l ls t a g ei nt h e c o c u l t u r eg t o u p sw e r er e m a r k a b l yl e s st h a nt h a ti nt h ec o n t r o lg r o u pq o 0 s n o d i f f e r e n c e sw e r ef o u n da m o n gt h ec o c u l t u r eg r o u p s t h eb l o c k e de m b r y o sd i dn o tc l e a v e a 矗日2 4 h i nc o n c l u s i o n t h eb o v i n ee n d o m e t f i a lc e l l sc o u l di m p r o v et h ed e v e l o p m e n t a l b l o c ki n2 c e l ls t a g ee f f i c i e n t l y 2 t h er a t e so ff o r m a t i o no ff o u rt oc i g h t c e l l m o r u l aa n db l a s t o c y s tw e r es i g n i f i c a n t l y h i g h e r 0 5 i nc o c u l t u r eg r o u p st h a nt h o s ei i lc o n t r o lg r o u p t h er a t e so ff o r m a t i o no f h a t c h i n gb l a s t o c y s t sw 盯en o t a b l yh i g h e r p o 0 5 i nt h ep r i m a r yg r o u p t h ee a r l yp a s s a g e g r o u pa n dt h ep o s t e r y o t h a w e dp a s s a g eg r o u pt h a nt h o s ei nc o n t r o lg r o u p f u r t h e r m o r e t h er a t e so ff o r m a t i o no fm o r u l a b l a s t o c y s ta n dh a t c h i n gb l a s t o c y s tw 黜r e m a r k a b l y h i 曲e r p o 0 1 b e t w e e nt h ee a r l yp a s s a g eg r o u pa n dt h ep o s t e r y o t h a w e dp a s s a g eg r o u p t h a nt h o s ei nc o n t r o lg r o u p a tt h es a l l l et i m e t h o s ew e f es i m i l a ra m o n gt h ec o c u l t u r e g r o u p s t h ee a r l yp a s s a g eg r o u p t h ep o s t e r y o t h a w e dp a s s a g eg r o u p t h ep r i l n a r yg r o u p a n dt h el a t ep a s s a g eg r o u pe n d o m e t r i a lc e l l sm o n o l a y e r o t h e rt h a nt h eh a t c h i n g b l a s t o c y s tw o r er e m a r k a b l yh i g h e r 0 0 0 1 i nt h ee a r l yp a s s a g eg r o u pt h a nt h el a t e p a s s a g eg r o u p b u tt h e r ew a ss u b s e q u e n td d 2 t e a s et r e n do f t h ee f f e c to f c o c u l t u r ea n dt h e e a r l yp a s s a g ee n d o m c t r i a lc e i l so fc o c u l t u r ei st h eb e s t t h e s er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h e c o c u l t u r es y s t c mo fb o v i n ee n d o m e t r i a lc e l l ss u p p o r te a r l ye m b r y o n i cd e v e l o p m e n ta n d y i e l dar e a s o n a b l en u m b e ro f e m b r y o s w i t hg o o dq u a l i t yu pt ot h eb l a s t o c y s ts t a g e 3 t h er a t e so ff o r m a t i o no fh i g hq u a l i t ye m b r y o s g r o u p s1 2 3 4 w e r eh i g h e r 1 6 2 0 7 2 7 1 4 3 3 6 0 7 1 4 6 9 7 0 i n c o c u l t u r eg r o u p st h a nt h o s ei nc o n t r o lg r o u p 5 2 7 7 8 t h e r ew e r en os i g n i f i c a n td j f e r e n c ea m o n gt h ec o c u l t u r eg r o u p s g r o u p s 1 2 3 4 i ts u g g e s t e dt h a tt h eb o v i n ee n d o m e t r i a lc e l l sc a r lp r o m o t et h ed e v e l o p m e n ta n d e n h a n c et h eq u a l i t yi ne a r l y s t a g eo f m o u s ee m b r y o s k e yw o r d s c o c u l t u r e e m b r y od e v e l o p m e n t b o v i n ee n d o m e t r i a lc e l l s t h ee a r l yp o s t g e n e r a t i o n 4 1 文献综述 哺育动物早期胚胎体外共培养的研究进展 在离体培养哺乳类 包括人 受精卵时人们发现 在一些化学成分确定的培养基 中 受精卵往往不能发育到囊胚 而是停顿在某个特定的发育时期 这种现象被称作 发育阻断 发育阻滞的时期随物种不同而异 如 大鼠和小鼠的发育阻滞发生在 2 细胞期 人发生在4 8 细胞期 牛 羊等发生在8 1 6 细胞期 兔发生在桑葚胚期 这种发育阻滞的时间与胚胎发育中基因表达由母型向合子型过渡的时间基本吻合 2 l 为了克服胚胎体外发育阻断 人们采用胚胎与体细胞共同培养 c oc u l t u r e 的方法来促 进胚胎体外的早期发育 哺乳动物早期胚胎体外共培养是将早期胚胎与组织细胞共同 培养 通过胚胎与体细胞的相互作用 从而达到改善胚胎培养环境 提高胚胎发育到 囊胚的数量和质量的一种早期胚胎体外培养方法 实践证明 共培养技术可以改善胚 胎的体外培养效果 克服体外发育阻断 增加发育到囊胚期的胚胎数和囊胚的细胞数 p l 尽管近年来用成份明确的培养基已经能够使几种动物 如小鼠和牛 胚胎克服体 外阻断而发育到囊胚 但许多动物的胚胎在体外还必须依靠共培养才能发育到囊胚 期 此外 共培养对理解胚胎新陈代谢是很有用的工具 而且 在研究植入相关基因 表达和胚胎一子宫内膜相互作用方面 共培养仍是重要手段 4 l 1 1 共培养提高胚胎发育的机制 目前 关于共培养支持胚胎体外发育 克服发育阻断的原理并不清楚 共培养细 胞促进胚胎体外发育的机制复杂 可能是通过多途径而起到促进作用 且各种途径相 互作用 相互促进 很难用一两种机制解释清楚 现在发现的机制主要有以下几点 1 1 1 共培养细胞可分泌一些对早期胚胎有利的物质 目前研究最多的是生长因子和糖蛋白 促胚胎因子包括转化生长因子家族 胰岛 素和类胰岛素家族 成纤维细胞生长因子等 许多研究表明在简单培养中单独添加一 些生长因子能显著提高胚胎的体外发育 转化生长因子 t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r t g f a 和t g f 1 3 和表皮生长因子 e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r e g f 能显著提高牛早期胚 胎发育到囊胚的比率 5 1 e g f 能促进小鼠囊胚滋养层的蛋白合成 6 体外成熟培养液 中添加e g f 还加强了猫卵母细胞的细胞质成熟 7 1 胰岛素和类胰岛素生长因子 i n s u l i n l i k e 粤 o w t hf a c t o ri i g f i 能提高胚胎致密化和囊胚形成比例 促进蛋白质 合成 9 1 i n s u l i n l i k eg r o w t hf a c t o r i i i g f i i 是小鼠胚胎正常发育所必需的1 9 1 l a r s o n f 等 1 9 9 0 在简单培养基中添加t g f b 和牛纤维细胞生长因子 b o v i n ef i b r o b l a s tg r o w t h f a c t o r b f g i o 能使3 9 的牛早期胚胎通过8 细胞阻断 而对照组却无一通过阻吲1 0 l s c h u l t zg a 等人证明牛胚胎细胞中含有i g f i i g r 受体 l l s u bt k 等人证明牛胚 胎细胞中含有e g f t g f 受体 1 2 l 这些实验都为生长因子能促进胚胎的生长发育提 供了理论依据 同时许多研究者在不同的胚胎体外共培养体系中检测到各种生长因 子 d e s a l 等 1 9 9 8 检测了人体外受精任v i t r of e r t i l i z a t i o n n r f 胚胎与非洲绿猴肾 细胞 w r o 细胞共培养时 v e r o 细胞释放的生长因子 细胞因子 包括血小板生长因子 p l a t e l e t d e r i v e dg r o w t hf a c t o r p d g f 转化生长因子 b t g f b 白细胞介素 6 i n t e r l e u k i n m o 白血病抑制因子 1 e u k e n l i ai n h i b i t o r yf a c t o r u f 和表皮生长因子 e g f 于v v r o 细胞接种后的第2 3 4 5 和6 天 分别收集培养液中的上清液 用抗生长因子 细胞因子的酶联免疫反应进行检测 所有样品的条件培养液都含有 i l 6 p d g f 和l i f i l 6 的浓度由接种后第2 天的2 9 4 p 孔上升到第6 天的1 6 0 0 p g 孔 共培养中的p d g f 也快速增多 从培养早期的1 9 4 0 p 孔升高到共培养第6 天的 5 0 0 p 孔 这些结果表明在共培养中 胚胎处于生长因子和细胞因子浓度升高的动力 学环境中 l n i n ad e s a l 等在小鼠的胚胎培养中加入不同的生长因子并和共培养做 比较 发现小鼠胚胎在共培养中无论是细胞数还是冷冻解冻后的孵化率都大于对照 组 结果说明生长因子对小鼠的生长发育起一定作用 但单独添加生长因子组效果不 如共培养组 说明共培养细胞除了通过分泌细胞生长因子促进胚胎发育外 可能还有 别的促进途径 i w a t s o n 等 1 9 9 2 用反转录d n a 扩增法证明 在牛和绵羊上皮细胞 中有i g f i i g f l i t g f d t g f 8 和f g f 的m r n a 转录 瑚 由此可见 共培 养细胞能分泌大量的生长因子 李逸平等 1 9 9 3 利用兔输卵管上皮细胞分泌蛋白的电 泳图谱 确定糖蛋白的分子量范围介于4 4 6 8 k d 其中以6 8 k d 区带最为明显 提示 体外培养的输卵管上皮细胞分泌糖蛋白 他们用i 晓5 标记示踪技术分析不同发育时间 大鼠早期胚胎透明带中的分泌性糖蛋白的情况发现 与兔输卵管上皮细胞共培养的大 鼠胚胎 其透明带上都结合有6 8 k d 的蛋白质 而对照中未发现这条特征蛋白区带 m l 说明输卵管上皮细胞分泌的糖蛋白对胚胎发育有作用 1 1 2 共培养可降低培养环境中氧自由基 高氧环境易在胚胎培养液中产生氧自由基 尽管氧自由基在培养液中的具体浓度 还不知道 但通过往培养液中添加氧自由基清除剂如亚牛磺酸等能提高胚胎的发育及 6 胚胎在5 氧气中的发育好于在2 0 氧气环境中的发育 推测氧自由基可能对胚胎的 发育产生不利影响 尤其在胚胎由母源基因控制转向合子型基因控制这一胚胎对外界 刺激敏感时期 i 七q u a r r e 等人通过把培养环境中的氧气浓度从2 0 降到5 发现更多 的牛早期胚胎的第4 次细胞分裂时间大大缩短 即胚胎由母源基因控制向合子型基因 控制的过渡时间大大缩短 虽然卵裂率二者没有差异 但在5 氧气环境中胚胎发育 到囊胚的比率显著高于2 0 氧气环境 p 0 0 1 t m 这说明低氧环境对胚胎的体外生长 发育更有利 j o o 等将小鼠的体内1 细胞胚胎与人输卵管细胞共培养时发现共培养组 的氧自由基的浓度明显降低 且胚胎发育到囊胚的比例也较对照组显著提高 堋 说明 共培养细胞可以消除氧自由基对胚胎的不利影响 r i z o s 等人以s o f a a 为基础培养液 比较了5 氧气和2 0 氧气环境对牛早期受精胚在简单培养和颗粒细胞单层共培养中 的影响 发现不同的氧气浓度对胚胎在s o f a a 简单培养液中的发育有显著影响 在 5 的氧气中囊胚的发育率达到3 2 2 而在2 0 氧气环境中囊胚的发育率只1 8 7 但在颗粒细胞单层共培养中 氧气的浓度对胚胎的发育没有显著影响 2 7 1 v s 2 6 7 嘲 1 1 3 通过饲养层细胞的代谢 改变培养液的一些成分的含量 现今所用的早期胚胎培养液有简单培养液和复杂培养液 但不管是哪种培养液 和胚胎在体内的发育环境都有很大的差异 如在牛 羊上广泛使用的s o f 液只是模 拟了羊输卵管中的各种离子浓度 和真正的输卵管液相比 其差距是很大的 在培养 液中加入体细胞 通过体细胞代谢 从而改变培养液中的各种成分的含量 创造一个 更利于早期胚胎生长的环境 如葡萄糖对牛 羊等动物早期胚胎的体外发育是有害的 且它是造成体外培养早期胚胎发育阻滞的主要原因 牛 羊胚胎在体外培养 早期能 源物质主要以丙酮酸和乳酸为主 到桑葚胚以后能源物质才开始以葡萄糖为主 r i e n g e r 等人检测到共培养体系中葡萄糖的浓度大大减少 而乳酸的浓度却有所增加 这说明共培养的细胞能代谢培养液中的大量葡萄糖 葡萄糖浓度在共培养体系中降 低 从而促进早期胚胎克服阻滞 2 0 1 1 4 其它 目前有许多学者以新颖的研究思路探讨了共培养对胚胎发育影响的作用机制 总 结如下 胚胎与细胞的直接接触有利于有害成份的排除 鼠单细胞胚胎与人输卵管 上皮细胞共培养 与条件培养液和用一种细胞培养架使胚胎与细胞不直接接触的共培 7 养作对照 测定胚胎培养至囊胚孵出阶段的百分比及各种培养条件下的上清液中超氧 阴离子的水平 结果显示 在无直接接触的共培养组中未观察到共培养的作用 直接 接触的共培养组中囊胚孵出率增加 超氧阴离子的水平显著减少 认为共培养促进胚 胎的发育机制可能是胚胎与辅助细胞间直接的细胞与细胞的接触 从而通过最初的简 单转导旁路活化胚胎基因组的表达 并且共培养有利于有害成份如超氧阴离子的排 除 而不只是胚胎营养因子的作用 j 8 v e t o 细胞g n r hm r n a 和蛋白的表达在共 培养的早期胚胎与予宫内膜交流中起重要作用 并且由于共培养细胞g n r h 的表达而 产生胚胎营养因子的作用 2 1 1 作者分析由于在人类子宫内膜g n r h 和其受体m r n a 和蛋白在整个月经周期均有表达 种植前胚胎同样有其它激素和受体的表达 从而提 出上述观点 即用于胚胎共培养的v e t o 单层细胞可以提供一个类似于子宫内膜的环 境 通过共培养细胞c m r b 调节旁分泌产生胚胎营养因子的作用 x uj i a s e n 等人 认为共培养是通过减少胚胎细胞凋亡而起到促进胚胎发育的作用的阱1 在不同哺乳动 物胚胎发育中 凋亡是常见现象 体内发育的囊胚具有典型的凋亡特点 如染色体凝 集和碎片形成 细胞皱缩 多个细胞碎片 培养中鼠胚的凋亡受不同培养液的影响 且比体内发育的囊胚有着更明显的凋亡 体外加入一些细胞因子如t g f a 可减少凋 亡 从形态学上看细胞浆中碎片的减少可能是凋亡减少的结果 末端d n a 转移酶d u t 缺口末端标记法 t u n e r 9 检测凋亡过程中原位d n a 的断裂 该方法利用末端脱氧核 甘酸转移酶与d n a3 o h 末端的特异结合 广泛用于检侧组织 细胞和胚胎凋亡 通过对共培养的胚胎与传统培养的胚胎凋亡的检查 首次报道人输卵管细胞减少种植 前胚胎的凋亡 是共培养的作用机制 因为共培养后凋亡减少 内胞t 羽 i c m 和滋养 外胚层f r e 细胞增加 为胚胎发育到囊胚准备了更多的卵裂球c o l a s t o m e r e 1 2 影响共培养效果的因素 胚胎体外共培养系统包括共培养细胞 胚胎 培养液及培养环境 胚胎在共培养 体系中培养比在简单培养液中培养多了共培养细胞 因此影响因素更复杂 凡是影响 胚胎在简单培养液中发育的因素都影响其在共培养中的效果 同时影响共培养细胞发 育的因素也间接地影响胚胎的发育 1 2 1 共培养细胞 1 2 1 i 共培养细胞的种类 1 同种体细胞共培养 e y e s t o n e 等 1 9 8 9 将牛卵母细胞体外成熟体外受精0 v m r v v 胚胎与输卵管细胞 在m 1 9 9 液中共培养 共培养组与对照组的2 一细胞胚胎数没有差别 但培养5 d 后 共培养组中大于1 6 细胞的胚胎数 3 5 对7 和发育到桑葚胚和囊胚的胚胎数 2 2 对3 都明显高于对照组 共培养胚胎移植5 5 的受体牛怀孕并产下牛裂3 1 关于体 细胞类型对胚胎发育的影响也有研究 g o t o 等将牛i v m i v f 胚胎分别与颗粒细胞 输卵管细胞和子宫细胞在m 1 9 9 液中共培养 囊胚率分别为2 6 9 3 7 5 和3 9 2 差异不显著 说明体细胞的类型对牛早期胚胎发育影响不大 但p r i c h a r d 等 1 9 9 2 将山羊自然交配后2 4 细胞胚胎分别与输卵管上皮细胞和子宫上皮细胞在m 1 9 9 液中 共培养 发现与输卵管上皮细胞共培养比与子宫上皮细胞共培养囊胚率和孵出囊胚率 明显提高 2 4 1 因此 不同动物的早期胚胎对共培养细胞的要求可能是不一样的 e u i n g t o n 等发现 牛 f 胚胎与新鲜的输卵管上皮细胞共培养比与冻融的输卵管 上皮细胞共培养的囊胚细胞数明显增加f 2 5 1 可能由于新鲜的输卵管上皮细胞代谢活性 强 分泌的生长因子和其他活性物质较多的缘故 因此 共培养细胞最好选用新鲜的 细胞单层 共培养所用的培养液对胚胎发育也有影响 c a r n e y 等 1 9 9 0 将兔的体内1 细胞胚胎分别用h a m sf 1 0 m 1 9 9 和c z b 培养液与输卵管上皮细胞共培养发现 在 m 1 9 9 培养液中培养的囊胚率和细胞数比在其他培养液中更耐2 6 1 但也有关于共培养效果不明显的报道 w e t z e l s 等 1 9 9 8 将人 f 胚胎与成纤维 细胞共培养2 d 第三天进行胚胎移植 发现共培养与对照组相比 妊娠率 细胞数 目和胚胎质量上没有差别 2 q c a r n e y 等 1 9 9 0 将兔体内2 细胞胚胎分别与兔输卵管上 皮细胞 肾上皮样细胞系0 l k l 3 表皮上皮样细胞系 s v l 和皮肤成纤维样细胞系 r a b 9 在合成培养液 中共培养 结果与体细胞共培养 7 7 9 3 的胚胎发育到囊 胚 6 0 7 6 的胚胎从透明带中孵出 但对照组中也有9 0 的胚胎发育到囊胚 8 3 的胚胎孵出 统计表明两组差异不明显哪 2 异种体细胞共培养 鉴于发育阻滞在哺乳类中属普遍现象 各种动物的体细胞可能都有克服发育阻滞 的作用 若能用异种体细胞进行胚胎共培养 无疑会大大方便胚胎培养工作 为此 人们探讨了异种体细胞共培养的问题 z e n g 等 1 9 9 8 利用人输卵管上皮细胞与小鼠的 体内2 一细胞胚胎在无血清的d m e m f 1 2 液中共培养 结果8 2 的胚胎发育到桑葚胚 7 7 的发育到囊胚 6 3 的囊胚孵出 而对照组中 4 5 的胚胎发育到桑葚胚 1 3 的胚胎发育到囊胚 无囊胚孵出 共培养胚胎卵裂速度明显高于对照组 细胞碎裂也 9 少1 2 9 1 表明人输卵管上皮细胞能支持小鼠的早期胚胎发育 p e g o r a r o 等 1 9 9 8 将牛 i v m i v f 胚胎分别与牛输卵管上皮细胞和绿猴肾细胞 v e t o 在b 2 液中共培养7 8 d 发 现 与v e t o 细胞共培养的胚胎比与输卵管上皮细胞共培养的胚胎细胞数目明显增多 3 0 l 说明牛早期胚胎与v e t o 细胞共培养效果更好 g o t o 等将牛i v f 胚胎分别与牛颗粒细胞 l o 日龄鸡胚皮肤细胞 1 0 日龄小鼠胚 胎的睾丸细胞和l o 日龄鸡胚胎的肝细胞在m 1 9 9 液中共培养 发育到囊胚的比率分 别为5 3 3 4 2 9 4 9 3 和4 4 3 差异不显著 2 3 1 因此 同种体细胞或异种体细 胞对牛胚胎发育的影响差别不大 q u h i b i 等将小鼠的体内1 细胞胚胎分别与牛肾细胞 m d b k 和v e t o 细胞共培养发现 胚胎与m d b k 细胞共培养获得的囊胚率高 6 7 而与v e t o 细胞共培养的胚胎 不能通过2 细胞发育阻断 3 表明v e t o 细胞不能支持 小鼠早期胚胎发育 上述结果说明 1 同一种细胞系对不同动物的胚胎发育影响可能不同 2 不同 动物的早期胚胎对共培养体细胞的种类和种属特异性要求可能不同 牛胚胎与同种和 异种动物不同类型体细胞共培养效果都很好 而兔早期胚胎与多种体细胞共培养发育 效果都不明显 1 2 1 2 共培养细胞所处的生理状态 对于和生殖有关的细胞如输卵管上皮细胞 子宫内膜细胞等 细胞内都含有各种 生殖激素受体并随着机体的不同生理周期而表现出不同的生理状态 x i ap i n g 等用e 2 处理供体动物后 发现输卵管上皮细胞在体外培养时分泌的蛋白质发生改变 s d s 凝胶电泳显示一种分子量为8 2 0 0 0 m r 的蛋白质停止分泌 分泌另一种分子量为 3 3 0 0 0 m r 的蛋白质 同时分子量为9 7 0 0 0 和3 6 0 0 0 4 5 0 0 0 m r 的蛋白质分泌量大大增 加 用e 2 处理的输卵管上皮细胞培养牛体外受精胚囊胚率显著高于未用e 2 处理纠3 2 1 k a m i s h i t a 等比较了牛p 4 控制期输卵管上皮细胞和e 2 控制期输卵管上皮细胞对牛早期 胚胎体外共培养的效果 发现b 2 控制期囊胚率达到3 2 6 而p 4 控制期的囊胚率只有 1 9 8 p 钱云等发现表面布满卵泡的猪输卵管上皮细胞共培养 p o r c i n eo v i d u c t a le p i t h e l i a l c e l l s p o e c s 卵裂率显著低于卵巢表面有黄体和 或红体的p o e c s 共培养组 p o 0 5 虽然各组间3 4 细胞胚胎的发育率无显著差异 但卵巢表面有红体和 或黄体的 p o e c s 共培养组的4 一细胞期以上胚胎的发育率显著高于卵巢表面布满卵泡的 p o e c s 共培养组 p o 0 5 t u q i a ny 等比较了猪受精卵分别与颗粒细胞 组1 卵泡 期 组2 排卵期 组3 和黄体期 组4 的猪输卵管上皮细胞共培养的效果 发现组2 1 0 中猪受精卵发育到2 一细胞期的数量比其它三组显著低f p o 0 5 组3 和组4 中受精 卵发育到4 一细胞期及以上的胚胎数比组1 和组2 显著高f e o 0 5 受精后1 4 4 h 组 1 3 4 中分别有1 2 o 1 4 8 和2 0 o 的卵母细胞发育到胚泡期 然而 组2 中 没有胚胎发育至胚泡期 说明猪排卵期和黄体期的输卵管上皮细胞共培养体系比卵泡 期的输卵管上皮细胞及颗粒细胞能更好地支持猪胚的发育 3 5 1 2 1 3 共培养细胞的传代次数 制备共培养细胞的传代次数对共培养效果很重要 传代次数过多使细胞的某些生 物学特性丢失 细胞原有的功能降低 影响其促进胚胎发育的功能 细胞免疫化学检 测显示 原代培养的输卵管上皮细胞绝大多数呈角蛋白染色阳性 波形蛋白阳性细胞 不足2 传代至4 代以内 角蛋白染色阳性占9 0 以上 但传代至第5 6 代时细胞 形态变化 波形蛋白阳性细胞明显增加闭 这说明随着传代次数的增多 培养细胞的 形态和功能发生改变 钟瑜等人研究了不同传代次数和传代后同一培养时间人输卵管 上皮细胞对小鼠胚胎体外发育的影响 发现l 一4 代的细胞培养小鼠2 一细胞胚胎效果 最好 第4 代以后细胞促进胚胎发育的作用有逐渐降低的趋势 这可能是上皮细胞逐 渐为成纤维细胞所取代 分泌能力下降 同时传代次数多了引起细胞活力下降所致 传代后第四天的效果优于第一天 可能细胞经过4 5 天的培养后 细胞贴壁稳定生长 细胞分泌产物多且稳定所致阅 1 2 2 培养液 胚胎培养液基本上分为三类 i 类是化学成分简单 明确的培养液 是凭经验配 制 例如e a r l e s 平衡盐溶液 e b s s i 类则是根据输卵管液的组成而配制 例如人 类输卵管液饵 i d 牛 羊上的s o f a a c r i 等 小鼠上的c z b k s o m 等 这些培 养液成分简单 主要模仿动物输卵管液的离子浓度而设计的 利于早期胚胎克服阻滞 这两类培养液均为简单的碳酸氢盐缓冲盐溶液 补充能源 例如丙酮酸盐 乳酸盐和 葡萄糖 抗菌素以及一个高分子量组分 例如血清 白蛋白或聚乙烯醇 配成 类是 复合 培养液 含有多种原为体细胞培养而设的成份 复杂培养液营养丰富 但往 往不是针对胚胎培养而设计的 所以可能含有一些对早期胚胎发育不利的因子 如现 在常用于做胚胎共培养液的t c m l 9 9 其主要是为细胞培养而设计的 含有高浓度的 葡萄糖和磷酸根离子 对牛早期胚胎克服阻滞是不利的 传统上认为早期胚胎和共培养细胞对营养物质的需求不同 比较复杂的培养液才 能提供共培养细胞的营养 在牛 羊多用t c m l 9 9 人 小鼠上多用h a m sf 1 0 m 1 6 等 但近年来越来越多的实验发现简单培养液其实更利于胚胎在共培养体系中的发 育 r i z o s 等比较了牛体外受精胚在t c m l 9 9 g c m 颗粒细胞 和s o f g c m 中的发育 发现在s o f g c m 中的胚胎囊胚发育率和t c m l 9 9 g c m 中的差异不显著 但冷冻 解冻后在s o f g c m 中得到的胚胎存活率更高 且冷冻 解冻后的胚胎培养以 s o f g c m 体系好于t c m l 9 9 g c m 培养体系 1 9 1 w r c 扰z y k i 等比较了牛体外受精胚分 别在t c m l 9 9 和s o f a a 液中的一些重要基因的转录情况 发现在s o f a a 中培养的胚 胎其一些重要基因转录的种类及量较t c m l 9 9 更接近体内胚胎的基因转录 这说明 s o f a a 可能比t c m l 9 9 更适合作为牛胚胎的体外培养液 3 8 除了培养液的种类对胚胎的发育有重要影响外 培养液中的添加成分对共培养胚 胎的发育也有重要的影响 m i s h r a 等研究了在牛胚胎与输卵管共培养中添加l h 对胚 胎发育的影响 发现在胚胎单独培养中添加l h 对胚胎的发育没有显著影响 但当胚 胎与输卵管上皮细胞共培养时添加l h 能显著提高囊胚的发育率 4 2 尽管哺育动物卵 母细胞中包含l h 受体 3 9 舯 但单独在其中添加对卵母细胞的