制备型色谱柱选择指南.doc

制备型色谱柱选择指南制备的目的是从混合物中得到纯物质，即分离纯化目标物,制备柱则是完成这一过程的一个工具。其固定相种类和分析柱相似，有硅胶、键合固定相（如C18/C8等）、离子交换树脂 、聚酰胺、 氧化铝、 凝胶等（对填料可以进一步处理提高了分离效果，如：对硅胶进行的硝酸银（或缓冲液）处理）。其装柱方法，根据固定相颗粒度和柱子的尺寸，有不同的装柱方法，装填越好分离效果越好。如湿法装填，颗粒直径小于2030um的固定相，柱直径在50mm以内（同分析柱装填方法相似）；还有如径向压缩或轴向压缩，柱长压缩技术，柱直径大于50mm时采用。这种方法，先将固定相悬浆（或偶尔是干填充物）装入柱中加压，利用物理方法将其压紧。压缩.jpg(15.38 K)2011-9-14 15:23:19（轴向压缩图例）为了加快分离时间和提高分离效率，制备色谱的的进样品量将会很大，这导致制备色谱柱的分离负荷的相应加大，也就必须加大色谱柱填料，增大制备色谱柱的直径和长度，使用的相对多的流动相。然而，当色谱柱上样量加大时，往往会导致柱效急剧下降而得不到纯的产品。制备色谱，要解决容量与柱效之间的矛盾。因此，制备柱的特点往往是：1. 柱长短、内径大、呈圆饼状。常用制备柱的柱长与分析柱相仿,一般为20 50cm ,而内径为10 1 000mm ,因此可以在较大的流速下不致产生很高的柱压降,从而获得高的产率。2. 填料颗粒小，分布窄。采用直径为10 20m 的细颗粒,孔径及粒度分布均很窄的多孔球形或非球形填料替代传统大颗粒(40 200m) 、宽分布的无定形填料填充制备柱,因而具有高得多的柱效,通常每米的塔板数在20000以上,有的甚至可达到与分析柱相仿的柱效。3. 流速高。流动相的线速一般在5 10cm/min ,以便提高产率,降低生产成本。 制备色谱柱50mm以内，可以使用预装柱，但是50mm以上就必须使用轴向压缩柱。轴向压缩柱可分为静态和动态轴向压缩柱。一般50100mm可以使用静态或动态轴向压缩柱，但是100m以上制备柱必须使用动态轴向压缩柱。制备柱.jpg(21.78 K)2011-9-14 15:23:19（典型制备柱图例）那么，如何选择一款合适的制备柱呢？第一步：选择合适的填料。越小的粒径具有越高的柱效，但是价格更高，并且带来更高的柱压，要求设备的硬件具备更高的压力耐受性。在被测组分的色谱峰与其它色谱峰非常靠近时，就需要更高的柱效，此时较小粒径的色谱填料就显得非常有用。相反，越大的粒径则柱效越低，但价格也相对较低，同时对设备的要求也不高（10um最常用）。填料.jpg(14.66 K)2011-9-14 15:23:19（填料）第二步：针对蛋白质、多肽类等物质，选择合适的键合相、孔径。由目前市场需求来看，蛋白质、多肽等类的物质分离纯化十分普遍，其中以C18、C8、C4的键合相居多，如何根据物质分子量的大小，来选择合适的含碳量和粒径是个非常重要的问题。而相同粒径不同孔径的效果也有不同，如100A、200A等，因此，孔径的选择也十分重要。孔径和粒径.jpg(11.23 K)2011-9-14 15:23:19（孔径和粒径的关系图）物理性质 硅胶纯度 色谱柱尺寸 颗粒形状 粒径 表面积 孔径 键合类型 碳覆盖率 封端 化学性质粒径分布.jpg(19.83 K)2011-9-14 15:23:19第三步：选择合适的柱管。样品的上样要与色谱柱的交叉截面面积相对称，要选择色谱柱的内径要适合于样品的上样量（21.2最常用）。越长的色谱柱具有越高的柱效和更高的样品承载量，但是柱压将会更高，同时分离时间可能会更长（250mm最常用）。第四步：确定合适的流速和上样量制备型色谱柱的流速：一般与直径的平方成正比。举例：4.6mm分析柱流速设为为1mL/min，10mm制备型色谱柱可以为1*（10/4.6）2，约为4.7ml/min。上样量的多少即超载多少，这是为了节约溶剂、节省时间、增加柱子的使用率，因此上样量都是超载的。但并不是超载越多就越好，因为超载越多、塔板数越低。一般情况下，是否超载过量，可以以柱效下降一半为标准，在此基础上再超载，所得到的物质纯度就会受到影响，反而达不到目的。允许平头峰：