（生物医学工程专业论文）温度敏感聚异丙基丙烯酰胺聚精氨酸缀合物转基因载体.pdf

a b s t r a c t i n t h i sw o r k , at h e r m o r e s p o n s i v ep o l y ( n - i s o p r o p y l a e r y l a m i d e ) p o l y - l - a r g i n i n e b i o e o n j u g a t e ( p n i p a r g ) w a sp r e p a r e d t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e np n i p a r ga n dp l a s m i d d n a , a n dt e m p e r a t u r et u n a b l ep n i p a r gm e d i a t e dg o n ed e l i v e r yi n t oc 2 c 1 2c e l l s w e r ei n v e s t i g a t e d t h em a i nw o r ki ss u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 at h e r m o r e s p o n s i v eb i o e o n j u g a t ep o l y ( n i s o p r o p y l a e r y l a m i d e ) p o l y - i 广a r g i n i n e w a ss y n t h e s i z e db yr a d i c a lp o l y m e r i z a t i o na n de d c c o u p l i n g t h ef o r m a t i o no f p n i p a r gw a sc o n f i r m e db yf t i ra n d ”cn m r t h el o w e rc r i t i c a ls o l u t i o n t e m p e r a t u r e ( l e s t ) o fp n i p a r ga q u e o u ss o l u t i o nd e t e r m i n e db yt u r b i d i m e t r y w a sa r o u n d3 5 2 c 2 t h ep h y s i e h e m i e a lp r o p e r t i e so fp n i p a r g d n ac o m p l e x e sw 6 t oe x a m i n e db ya v a r i e t yo f m e t h o d s t h ei n f l u e n c eo f t e m p e r a t u r es e n s i t i v e n e s so nt h ef o r m a t i o n , p a r t i c l e s i z ea n ds t a b i l i t yo fc o m p l e x e sw a gi n v e s t i g a t e d t h er e s u l t so f t r a n s m i s s i o ne l e c t r o n m i c r o s c o p e ( t e m ) s h o w e d 也a tt h ep n i p a r g d n a c o m p l e x e sa p p e a r e du n i f o r mn a n o s p h c r e sw i t hs i z ea b o u t5 0 - 1 0 0 n m c i r c u l a r d i e h r o i s m ( c d lv e r i f i e dt h a tt h ec o n f o r m a t i o no f p l a s m i dd n ar e m a i n e da l m o s t u n c h a n g e di nt h ec o m p l e x ，w h i c hb e c a m ed e n s e ra tat e m p e r a t u r ea b o v el c s z a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r a s i sa n dd n a s eia s s a yr e v e a l e dt h a tt h ef o r m a t i o na n d s t a b i l i t yo f t h ee o m p l c x e sw e r ei m p r o v e db yi n c r e a s i n gt e r a p e r a t u r e 3 t h et r a n s f e e t i o ne f f i c i e n c yo fp o l y - l - a r g i n i n ea n dp n i p a r gw a se v a l u a t e di n c 2 c 1 2c e l l su s i n gt w od i f f e r e n tr e p o r t e rs y s m n s ，p g l 3e n c o d i n gf o ri u c i f e r a s e a n dp e g p - c 1 c o d i n gf o rg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ( g f p ) 1 1 1 er e s u l t si n d i c a t e d t h a tp n i p a r gw a sa b l et ot r a n s f e rp g l 3a n dp e g p c 1 s u c c e s s f u l l y a c e n 仃o l l a b l eg o n et r a n s f e c t i o na n de x p r e s s i o nc o u l db er e a l i z e db ys e l e c t i n ga v a r ia ：b l ec u l t u r et e m p e r a t u r er o m c k e y w o r d s ：p o l y ( n i s o p r o p y l a e r y l a m i d c ) ；p o l y - l - a r g i n i n e ；t h e r m o r e s p o n s i v e ； g e n et r a n s f e c t i o n ；n o n v i r a lv e c t o r 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得盘洼盘茎或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：哥毪夥 签字日期：阳彩年月f 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解叁生盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权墨鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：习翟禺 导师签名： 痧7 囟庄 签字日期：7 形年f 月，日签字日期：如。6 年f 月f 明 第一章绪论 1 1引言 第一章绪论 现今仍有许多疾病是人类无法攻克的，而基因治疗为医治基因缺陷类疾病 ( 例如，囊肿性纤维化) 和病毒感染( 例如，乙肝和h i v ) 提供了潜在的有广阔 前景的治疗方法。基因治疗( g e n et h e r a p y ) 是分子生物学与现代医学相结合的 产物，是利用最先进的生命科学和临床医学的技术，通过导入正常或野生型( w i l d t y p e ) 基因矫正或置换致病基因的一种治疗方法。目前基因治疗的概念的外延有了 较大的扩展，凡是采用分子生物学的方法和原理，在核酸水平上开展的疾病治疗 方法都可称为基因治疗。基本策略包括( 1 ) 基因矫正治疗：对突变基因进行置 换、修正，在功能上替换病态基因；( 2 ) 基因灭活治疗：如利用反义r n a 、核 酶、肽核酸或s i r n a 等抑制异常基因如恶性肿瘤中的癌基因的表达；( 3 ) 基因 修饰治疗：导入外源基因，修饰、改变细胞的功能或使原有的功能得到加强。( 4 ) 免疫调节( i m m u n ea d j u s t m e n t ) ：将抗体、抗原或细胞因子的基因导入患者体内， 改变病人的免疫状态，达到预防和治疗疾病的目的“1 基因治疗的应用需要解决三个重要的问题：基因的导入、运输和表达。基因 的导入是指将基因导入到体内；基因的运输是指基因从导入部位向目的细胞的核 内迁移的全过程，包括基因导入目的细胞的生物利用效率，基因的跨膜性能和在 胞内的运输等；表达是指治疗蛋白在细胞内的合成。因此理想的基因治疗需要一 个能够长期有效的无毒或低毒性的基因运输体系，这就突显选择适合的将基因导 入细胞的载体的重要性。 1 2 非病毒载体 一个理想的载体系统必须满足至少两个条件，即有效性和安全性。有效性包 括所介导的遗传物质能够高效地进入所期望的靶细胞，而且不被血浆或组织细胞 中各种补体以及各种酶所破坏。同时，转导基因能够透过核膜，进入细胞核，并 整合于染色体d n a 中，从而获得转基因的高效、稳定表达而发挥治疗作用。安 全性则是指用于基因转移的载体不会引起宿主严重的免疫反应，不会产生严重的 遗传毒性与细胞毒性，不会因发生同源重组、回复突变，导致野生病毒的产生， 不会导致生殖细胞的感染以及不会导致插入位点的基因失活与基因突变等”1 。 目前为止，科学家们已经开发了许多转基因载体，具体可以分为两类：病 第一章绪论 毒类载体和非病毒类载体。病毒载体包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相 关病毒、痘苗病毒载体和单纯疱疹病毒载体等；非病毒载体包括裸d n a 、脂质 体、高聚物载体和人造染色体等。不同的载体在复合d n a 、保护d n a 、毒性 和基因整合方面有不同的优缺点，常用载体的优缺点见表l 一1 。 表1 一l 不同转基因载体的比较 s s d n a 为单链d n a d s d n a 为双链d n a 目前，普遍用于基因治疗临床试验的载体仍以病毒载体为主。这些病毒载体 曾因其所表现出的多方面的优势给人们带来过希望，同时，也因其所存在的 多种潜在的危险给人们留下了遗憾。而非病毒载体可以克服病毒载体的许 多缺点，它不存在d n a 尺寸的限制，没有致病性和免疫源性，并且毒性较低， 因此现在越来越多的实验室选择研究非病毒载体作为转基因的载体。其通常是利 用亲水或是疏水的多价阳离子聚合物缩合重组的质粒或反义寡核苷酸，形成微 粒，通过细胞的内吞作用进入细胞内部。但是由于非病毒载体只能将d n a 带入 胞浆中，因此胞内的降解导致其转染效率较低，目前只能应用于体外的实验。所 以现今非病毒载体研究的主要问题就是如何减少d n a 的降解，提高其转染效率。 2 第一章绪论 图l l 中显示的就是非病毒载体和d n a 形成的复合物进入细胞的过程。通过 图1 一l 可以看出作为非病毒载体必须克服以下几个苛刻的条件；1 其必须能缩 合d n a ，形成中性或正电性的复合物，避免细胞毒性及与其它细胞或带电分子( 如 细胞外基质、蛋白特别是补体蛋白) 的相互作用，这在体内应用是很必要的；2 其必须能形成紧密稳定的能被细胞内在化的复合物，这有利于其在血流内扩散和 帘式内皮膜的外渗：3 其必须能够调控特定的细胞识别并进入目的细胞，减小非 特异的基因释放；4 其必须能够从内涵体中逃逸出来并能够释放外源基因在细胞 核内表达。成功的基因转运还需要保护d n a 免受细胞内核酶的降解，能从内吞小 泡中释放d n a 或者复合物，同时复合物必须能够在某一阶段解离，复合物扩散通 过胞质溶胶及d n a 高效进入细胞核内。目前所开发的非病毒载体还不能完全达到 这些要求。 1 2 1 裸d n a 图1 - 1 非病毒载体d n a 复合物的转基因过程示意图 裸d n a 是结构最简单的非病毒载体，由于其需要避开细胞内外的屏障才能 发挥作用，因此一般都采用物理方法( 如基因枪，超声波，电出孔) 导入基因转 染的特定部位( 如骨骼肌肉，肝脏，心肌) 。但裸d n a 缺乏靶向性，并且只能 3 第一章绪论 在局部作用，不能转染大量细胞，并且可能还需进行外科手术以暴露靶器官。 1 2 2 脂质体 脂质体是2 0 世纪6 0 年代英国学者b a n g h a m 等将磷脂分散在水中进行电镜观 察时发现并命名的。磷脂分散在水中自然形成多层囊泡，每一层均为脂质双分子 层。囊泡中央和各层之间被水相隔开，双分子层厚度约为4 n m ，这种具有类似于 生物膜结构的小囊称为脂质体( 1 i p o s o m e ) ，由于它的结构类似生物膜，又称为 人工生物膜。最初脂质体主要作为人工生物膜用于研究生物膜的结构和功能的关 系，1 9 7 2 年，g r e g o r i a d i s 和r y m a n 将脂质体用于药物载体，目前已成为很有发 展前途的药物载体“，。 。 脂质体通过与d n a 复合形成尺寸较小的，电中性或带正电的有利于进入细胞 膜的结构，并且可以保护d n a 不被核酸酶降解。目前应用最为广泛的非病毒载体 就是基于脂质体的人工合成的大分子。其主要是由疏水部分和极性的头部，以及 两者的连接部分组成，某些脂质体还含有许多天然或合成的聚阳离子( 如聚赖氨 酸，聚乙烯基亚胺) “”等。 g e r s h o n “1 于1 9 9 3 年使用电镜技术，研究了脂质体基的复合物的形成和结构 特征。他认为，阳离子脂质体最初结合到d n a 分子上，在核酸分子上形成成束 的囊泡聚合物。当聚合达到一定程度时，d n a 诱导的脂质体膜融合和脂质体诱 导的d n a 断裂同时发生，断裂后的d n a 分子被包封于重新形成的脂质体中。 后来，h u e b n e r ”1 等于1 9 9 9 年系统地阐述了复合物的结构特征及形成机理。他们 指出，复合物的形成与脂质体d n a 的电荷比例有密切联系。复合物有三种形式： ( 1 ) 由d n a 包裹的单层囊泡( 2 ) 由单层囊泡组成的寡聚复合物( 3 ) 多层囊 泡聚合物。并且他提出“脂质体滚动”：当一个由d n a 包裹的单层囊泡被另一 个“模板”囊泡吸附，随即发生断裂，沿着“模板”囊泡“滚动”，依此类推， 就形成了多层囊泡聚合物，这就解释了复合物缺口形成的原因。目前，这一观点 已逐渐为广大研究者所认可。 脂质体基的复合物进入细胞主要经过两个途径：细胞的内吞作用进入细胞和 直接与细胞膜融合进入细胞。w r o b e l 等曾以肝癌细胞( h e p g 2 ) 和中国仓鼠卵巢 ( c h o ) 细胞为靶细胞，研究了脂质体与细胞的融合过程，证明内吞作用是融合 的关键。在三磷酸腺苷( a t p ) 耗竭剂和高渗介质等抑制内吞作用的物质存在下， 脂质体只能与细胞表面结合，不能实现内吞作用，而此时转染效率较无抑制剂的 对照组相比低了许多。l e v c n t i s 。1 等发现阳离子脂质体与细胞融合活性和转染率 不一致，证明融合机制不是其转运的主要渠道。同时有研究表明只有大约2 的 复合物是通过直接的膜融合进入细胞。成功的脂质体基基因导入系统同样需要克 4 第一章绪论 服前面提到的几个困难：像含有阳离子的脂质体可以和负电性的细胞膜通过静电 相互作用结合，这一过程已经通过加入带负电的链霉蛋白酶可使其转染效率降低 和将细胞用聚赖氨酸预处理可增加其转染效率得到证明；f e l g n e r 和r i n g o l d “1 通过实验证明即使有2 0 - - 8 0 的质粒d n a 进入细胞内部，仅有低于1 的质粒 d n a 可以表达目的蛋白，因此载体对d n a 的保护作用也是至关重要的，而脂质体 将d n a 包裹在脂质体内部并使两者进行重新的融合，形成新的结构，可以减小核 酸酶的降解。 对阳离子脂质体d n a 复合物( l i p o p l e x ) 从细胞内释放d n a 的机制的研究 表明，阳离子脂质体一d n a 复合物进入细胞内与溶酶体( 1 y s o s o m e ) 膜融合，主要 分布于核周高度有序的管状结构中。如内涵体( e n d o s o m e ) 中，含有阳离子脂质 体d n a 复合物的核内体膜极不稳定，可以释放出复合物( h o p k i n s c ca 1 ) “”。 一毒 v 州v _ 弋 ? 舔褂虻嘲喁u 憾 图i 一2 常见的阳离子脂质体 第一章绪论 f a r h o o d 等在研究中也发现溶菌酶试剂氯醛的存在会抑制d n a 向细胞的传递 过程，因此，认为脂质体的主要功能是使内吞小泡去稳定化，将d n a 释放到细 胞中。 脂质体的结构对其转染效率有着很大的影响。有实验证明阳性头部，疏水部 分和连接部分都对转染有一定的影响：极性头部起到与质粒d n a 结合的作用，同 时还有助于脂质体d n a 复合物与细胞膜或细胞内其它组分的相互结合“”；连接 部分决定了脂质体的化学稳定性及被生物降解的能力，同时其长度和空间位置也 决定了极性头部的质子化能力和与核苷酸的磷酸基团的结合能力“”；疏水部分对 脂质体的卷曲能力和其与质膜结合后的流动性起到一定的影响。 到目前为止，已有许多阳离子脂质体被报道，并有一些脂质体已经商品化， 被用作研究基因转染载体的阳性参照( 如，l i p o f e c t a m i n e 及l i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 ，t r a n s f a s t “) 。常见的阳离子脂质体的结构如图1 2 。图中分别代表 n f n ， n 二甲基胺乙基) 胺基甲酰基 胆固醇( d c c h 0 1 ) 、3 1 2 ，3 - 二油酰氧- n - e 2 ( 精胺 羧基酰胺) 乙基 - n ，n - 二甲基1 丙基三氟乙酸铵( d o s p a ) 、n - 1 ( 2 ，3 二油 酰氧基) 丙基 - n ，n ，n 三甲基氯化铵( d o t m a ) 、双十八氨基甘氨酰精胺( d o g s ) 】。 对于目前大多数的脂质体的转染实验来说，加入中性脂质二油酰磷脂酰乙醇 胺( d o p e ) 可以提高转染效率。d o p e 是形成稳定单脂双层阳离子脂质体所必需 的，同时具有促膜融合作用，可以增加脂质膜的不稳定性，促进复合物被释放入 胞浆。z h o u “”等在电子显微镜下观察用d c c h o l d o p e 转染的细胞，结果表明d o p e 可扰动内吞体的被膜。进一步研究，中性脂质d o p e 加入阳离子脂质体可提高转 染效率，可通过改变阳离子脂质体中阳离子与中性脂质的比例得到不同的转染 率。此外，还有实验通过在脂质体外包被聚乙二醇( p 阱) 后再连接上特异性受 体增加转染的特异性导入“。 1 2 3 高分子载体 1 2 3 1 天然高分子载体及其衍生物 壳聚糖是高分子载体中比较典型的例子。壳聚糖是一种低毒性，低免疫源性， 生物可降解的天然碱性多糖，它是甲壳素脱乙酰基的产物，是由许多无规排列的 2 一氨基一2 一脱氧一d 一葡萄糖和2 一乙酰氨基一2 一脱氧一d 一葡萄糖的重复单元组成的线 性多糖，其结构类似于细胞外基质中的糖胺聚糖。由于壳聚糖具有增强生物大分 子药物的透膜能力以及生物粘附性和生物降解性，有助于增加生物大分子药物在 体内的吸收，因此在生物大分子药物运输体系中有良好的应用前景，目前已用作 6 第一章绪论 鼻部和眼部的药物释放载体。 m u m p e r “”等人首先提出了使用壳聚糖作载体将基因释放到细胞中。黄伟“” 等对壳聚糖纳米颗粒作为转基因载体进行初步研究后发现，基因纳米颗粒能够转 染人胚胎肾细胞( h e k 2 9 3 ) 和肝癌细胞( h e p g 2 ) ，基因能够在这两种细胞中表达， 证明了壳聚糖用作基因载体的可行性。 由于壳聚糖转染效率较低，研究者将更多的精力投入到壳聚糖的改性当中， 并合成开发出许多壳聚糖基的载体。 l e e 溉“1 等将可以在水中自缔合成胶束的脱氧胆酸引入到壳聚糖中，用作非 病毒载体。琼脂糖凝胶电泳阻滞条带的实验结果证实，脱氧胆酸壳聚糖自缔合体 与质粒d n a 间可以形成复合物。对c o s - 1 细胞的转染研究“表明，此复合物的 转染效率高于裸d n a ，这可能是壳聚糖疏水性的提高促进了与细胞膜磷脂双分子 层的相互作用，进而提高了基因的转运能力。 u c h e g b u 1 等将疏水性的棕榈酰基引入水溶性的乙二醇化壳聚糖中，利用棕 榈酰基间的疏水相互作用，冷冻干燥后形成了非共价键交联水凝胶，得到棕榈酰 化乙二醇壳聚糖( g c p ) 凝胶，并又将其季铵盐化，可以形成了稳定的聚合物胶 束缔合体，进一步的实验研究确认季胺盐化的棕榈酰化乙二醇壳聚糖无细胞毒性 及具有良好的血液相容性，这为其在体内进行药物和基因释放应用提供了前提条 件。 本研究组。”通过将不同长度的烷基侧链( 丁基、辛基、十二烷基、十六烷基) 引入到壳聚糖上，得到烷基化改性的壳聚糖( a c s ) 。通过实验证明增加疏水链段 的长度，可以促进自缔合现象在较低的浓度范围内发生。我们已经将其作为维生 素b 2 控释载体进行了研究，发现其可以提高壳聚糖的载药能力，并可以起到一 定的缓释作用。进一步地，我们将十二烷基化壳聚糖用于基因载体的研究1 ，通 过琼脂糖电泳和其与d n a 形成的复合物的d n a s ei 酶解实验证明了烷基化壳聚 糖和d n a 可以在较低的电荷比情况下形成复合物，并成功阻止了d n a s ei 的渗透， 从而起到保护d n a 防止酶解的作用。进一步以烷基化壳聚糖介导质粒d n a ( 含氯 霉素乙酰转移酶报告基因) 对c 2 c 1 2 细胞( 小鼠成肌细胞) 的转染研究表明，此 复合物的转染率高于壳聚糖及裸d n a 。因此推测疏水烷基的引入一方面有助于稳 定复合物的形成，另一方面减弱了壳聚糖与d n a 复合物的静电相互作用，有助于 复合物在细胞核内“解包装”( u n p a c k i n g ) ，因而促进了基因的表达。 其他的改性壳聚糖载体，包括特异性识别目的细胞的半乳糖改性的壳聚糖 位8 1 。p a r k 等将脱唾液酸血清类糖蛋白的配体半乳糖接到壳聚糖一接枝一葡聚糖 上，赋予其肝细胞的靶向性，并通过实验证明了其有效性；m a o 1 等人将运铁蛋 白结合到壳聚糖d n a 复合物表面，赋予肿瘤细胞靶向性，实验结果表明结合1 4 2 7 第一章绪论 运铁蛋白的复合物的转染率比改性之前增加一倍。 除壳聚糖外，胶原蛋白是一类被用于基因运送的天然物质，它是许多动物体 内含量最为丰富的蛋白质，由于其结构中含有共价交联的化学键因而具有很好的 强度，其包裹d n a 后进行鼠类的体内实验均有明显的治疗效果，而且胶原蛋白 藻酸微球包裹d n a 释放时间延长，可以作为控释材料使用1 。 此外，非病毒载体中研究较多的天然高分子还包括鱼精蛋白、组蛋白等，它 们经常和合成的高分子载体共混使用。一些信号肽和特异性受体配体也与d n a 结合用于基因治疗，即增加了细胞对d n a 的吸收作用，同时也促进基因的靶向性。 1 2 3 2 合成高分子载体 天然的高分子载体一般都具有很好的生物相容性和低毒性，但是目前所开发 的天然高分子载体的应用局限性也很大。因此研究人员也开发了许多合成高分子 载体。 1 2 3 2 1 聚乙烯基亚胺 聚乙烯基亚胺( p e i ) 是一类研究较为广泛的载体。其作为转基因载体主要 有两种结构：线性聚乙烯基亚胺( l - p e i ) 和支化聚乙烯基亚胺( b p e i ) ( 如图 1 - - 3 ) 。p e i 的叔胺氮原子可以质子化，人们形象的将其称为“质子海绵”。与其 他的高聚物载体( 聚赖氨酸等) 不同，p e i 在所有的p h 范围内都表现出很好的 缓冲能力，在生理p h 条件下，只有大约2 0 的p e i 被质子化”1 。p e i 有很高的 转基因的能力，被认为是由于其较高的正电荷密度，并基于这样的假设：当细胞 的囊泡的p h 值变为酸性时，质子化的p e i 可以发生渗透性溶胀使囊泡破裂，将 p e i 携带的d n a 由囊泡释放到胞浆中。虽然真正的机理还有待进一步研究，但 可以证明p e i 确实是转基因的有效载体o ”。 但较高的电荷密度使p e i 存在明显的细胞毒性，同时p e i 的转染效率远远低 于病毒载体。为了改善这种情况，研究人员们利用各种方式对p e i 进行改性，使 其优化，开发出许多改性的p e i m 】。 最常见的p e i 改性的方法是将聚乙二醇( p e g ) 接枝到p e i 上，得到p e g p e i ( 如图1 4 所示) 。将亲水性的p e g 接枝到p e i 上，可以减少巨噬细胞对载 体和d n a 形成的复合物的吞噬，同时在p e i 的表面形成类似刷子的亲水表层可 以较少p e i 自身的团聚作用，有利于载体结构的稳定。并且通过改变取代度，可 以得到较适宜的正电荷密度。由于减少了与d n a 复合的正电荷的密度，因此得 到的体外转染效率低于未改性的p e i 。但是p e g - - p e i 的优点也是显而易见的， 8 第一章绪论 那就是相对于未改性的p e i 来说，较低的细胞毒性，同时也增加了复合物的溶解 性。有研究发现对于未改性的p e i ，当d n a 的浓度达到3 5 0 i ig m l ，l - p e i ( 2 2 k d a ) 和d n a 的复合物有少量的沉淀，但对于p e g p e i d n a 来说，1 5 0 0l lg m l 浓度 的d n a 也不会产生沉淀。 但是将p e g 引入到p e i 中减少了可以质子化的氮原子的数量，因此该载体 与未改性的p e i 相比，不能很好的与d n a 复合，导致转染效率不高。s a g a r a 和 k i m 将半乳糖配体接入到p e i 的表面，再得到复合物( 如图1 - - 5 ) ，来增加复 合物和细胞结合的能力和特异性，并通过实验证明复合物和细胞膜的结合主要是 依靠配体一受体的特异性结合，而非静电作用。在转染实验中，用半乳糖改性的 p e i 和p e i 转染肝癌细胞( h e p g 2 ) 和n i h 3 t 3 细胞，会发现未改性的p e i 对两 种细胞的转染效率差不多，经半乳糖改性的p e i 对人体肝细胞的转染效率明显提 高，说明特异性结合的有效性。 一漆g 0 卞专f 气，芗、二zpe i 弋坩量 矽 9 第一章绪论 图1 4p e g 接枝p e i 的示意图 l 图1 - - 5p e g 改性p e i 接入半乳糖配体的合成方式 l w a g n e r 州等研究的上皮生长因子( e g f ) 改性的p e i 也是基于p e g p e i 得 到的，不过采取了与半乳糖改性p e i 的不同的合成策略，合成方式如图1 6 。 并发现e g f p e i 对有e g f 受体的细胞有很好的转染效率( 荧光素酶活力单位可 达到1 0 8 ) ，同时发现该复合物能抵御核酸酶的攻击。其他受体介导的p e i 载体还 包括运铁蛋白改性的p e i ，r g d 改性的p e i 啪1 ，抗c d 3 抗体改性的p e i 1 等。 l 业皿 p e i 图1 6p e o 改性p e i 接入上皮生长因子的合成方式 1 0 一篾 产 第一章绪论 同样地，也有人将线型p e i 和聚2 一乙基一2 一唑啉共聚，得到的聚合物在选 择适当的配比下也可以降低甚至消除对细胞的毒性，但其转染效率( 用荧光素酶 活力表示) 没有变化“。 其他的p e i 衍生物作为载体用于转基因的研究还包括p e i 接枝葡聚糖1 ，p e i 接枝蜂毒肽，十二烷基化的p e i m l ，p e i 接枝叶酸h 5 “等等。 1 2 3 2 2 多肽类 聚( l - 赖氨酸) ( p l l ) 是最早用于基因转运的阳离子聚合物之一，可以与脱 唾液酸糖蛋白结合靶向肝细胞。并且有实验发现p l l 可以被体内的胰蛋白酶降解 成人体所需的氨基酸，因此不存在滞留体内的问题。 但是p l l 将基因导入细胞的能力很低“”，因此目前的研究多集中在改性的 p l l 或与其他的载体的共混上。研究表明将含有脂质体的p l l 和d n a 形成复合物， 并进行体外实验，其效果好于单独的阳离子脂质体。类似，将p l l 的末端连接 亲水的p e g ，形成嵌段聚合物p e g p l l ，其转染效果优于单一的p l l 包覆d n a 的效 果1 。此外，p l l 接枝聚( l 一组氨酸) 和l 一色氨酸等进行哺乳动物细胞的转基 因研究也证明其良好的性能。 富精氨酸的多肽也已用于转基因载体的研究1 。富精氨酸的多肽大多从1 型人免疫缺陷病( 眦v - 1 ) t a t 蛋白和果蝇的触角足同源异型蛋白中得到，也可 从h i v _ 1r e v 结构蛋白和兽棚病毒的外壳蛋白中得到。已有报道证明其易于穿透 细胞膜，将外源的d n a 运送到细胞内，同时也有实验表明仅含有精氨酸的多肽也 具有同样的转基因的功能。w e n d e r 等的实验证实精氨酸有很好的核定位的能 力。f u t a k i 嘲3 等对聚精氨酸( 分子量在5 0 0 0 1 5 0 0 0 ) ，月桂酸改性的寡聚精氨 酸和十八烷基化的寡聚精氨酸的转染效率进行了研究，并发现接入疏水链段的聚 精氨酸的转染效率高于聚精氨酸l f l o 倍左右。 1 2 3 2 3 树状高分子载体 树状高分子载体用于基因转移的研究最早见于s z o k a 等的报道。s z o k a 一，等 于1 9 9 3 年使用热降解的多聚物进行了基因转导的探讨。通过对两个报告基因一 荧光素酶( 1 u c i f e r a s e ) 与b 一半乳糖苷酶( b - - g a l a c t o s i d a s e ) 基因在多种贴壁，或悬浮 培养哺乳类细胞中转导与表达的观察，开创了以纳米材料为载体介导基因转移的 先河。结果显示，树状高分子载体可介导上述基因在多种细胞的高效基因转移与 转基因的表达。同时，文章还对树状高分子载体介导基因转移的影响因素，比如 树状高分子与d n a 混合物的电荷比( 末端胺分子与磷酸基团的比例) 、树状高分 子的粒径等进行了初步的探讨。一系列聚酰氨基胺( p a m a m ) ”和含磷的树状 第一章绪论 高聚物也被用于转基因载体的研究。通过载体和d n a 的相互作用的实验发现，末 端含有氨基的树状高分子和d n a 的相互作用，并可以通过胞吞作用进入到胞浆 中，同时研究发现其星状结构使d n a 和末端的伯胺发生相互作用并保持了叔胺的 电中性吼“。当复合物从内涵体中释放时叔胺起到缓冲的作用，使内涵体溶胀， 有助于复合物从内吞囊泡中逃逸出来。在转染实验方面，s z o k a 和h a e n s l e r 对p a m a m 作为非病毒载体进行了研究，他们发现在体外转染实验中五代以上的 p a m a m 树状高聚物对许多细胞系的转染效率高于裸d n a ，特别是对于猴和人类肿 瘤细胞。t u r u n e n 等的体内转染实验发现，部分水解的聚酰氨基胺的树状高聚 物对兔的颈动脉的转染效率要好于支化p e i ，但r u d o l p h ”等通过实验发现其对 于肺部的转染效率低于支化p e i 。p a r k 等将l 一精氨酸接枝到聚酰氨基胺 ( p a b l a m a r g ) 上，并和l - - 赖氨酸接枝的聚酰氨基胺( p a m a m - l y s ) 进行比较发 现，p a m a m - a r g 显示出较好的作为非病毒载体的性能：低毒性以及较高的和细胞 复合的能力，同时通过转染人的肝癌细胞( h e p 6 2 ) ，小鼠神经母细胞瘤细胞( n e u r o 2 a ) 和鼠的血管平滑肌原代细胞表达荧光素酶报告基因得到的转染效率高于 p 舢i a m l y s ，和p e i 的转染效率相当。 1 2 3 2 4 温敏性高分子载体 虽然聚乙烯亚胺( p e i ) 和天然高分子壳聚糖( c s ) 及聚赖氨酸( p l l ) 在非 病毒载体领域的研究非常广泛，并存在自身的优势。但是它们同样存在许多很难 克服的缺陷。例如，p e i 的转染效率较高，但是其相当高的正电荷密度以及表现 出较强的膜破坏性和细胞毒性，限制了它的应用。c s 和p l l 也都是通过静电相 互左右和d n a 结合，虽然存在较好的生物相容性和低毒性，但是其静电相互作 用同样也限制其将d n a 从载体上解离下来，进而影响了基因的表达。 鉴于此，研究人员开始关注那些既能在运载d n a 进入细胞过程中与基因保 持较高的结合力，又能在需要时可以降低和基因的结合力达到释放d n a 目的的 新型载体。一条潜在的路线就是通过使用能够在不同p h 值或温度等条件下，发 生构象变化或相变的刺激响应( 智能) 聚合物来调控其与d n a 的结合。 聚异丙基丙烯酰胺在转基因载体上的应用就是上述考虑的结果。对于温度响 应聚合物来说，聚异丙基丙烯酰胺( p n i p a a m ) 在其低临界溶解温度( l c s t 在 3 2 3 4 ) 以下溶于水，高分子链段呈无规线团状；温度高于l c s t 时，p n i p a a m 从水中析出，链段呈密实的小球。p n i p a a m 的l c s t 可以通过加入疏水或亲水 的单体降低或是增加。将n i p a a m 与亲水的丙烯酸单体共聚可以升高其l c s t ， 甚至使其消失。n i p a a m 和疏水单体，例如月桂酸乙烯酯、n 丁基丙烯酰胺可以 明显降低其l c s t 。同时有研究将n i p a a m 和丙烯酸( a a c ) 或是n ，n ( - - 甲基胺 1 2 第一章绪论 乙基) 甲基丙烯酸酯( d m a e m a ) 共聚可以得到p h 和温度双重响应性的高聚 物。p n i p a a m 的温度敏感性被广泛地应用于生物医学领域，包括温敏性药物释 放体系、调控细胞吸附和温敏性分离膜等。 h i n r i c h s ”等将异丙基丙烯酰胺( n i p a a m ) 与n ，n ( 二甲基胺乙基) 甲基 丙烯酸酯( d m a e m a ) 的共聚物作为温度和p h 值响应的基因治疗载体，其中 n i p a a m 提供温度响应性，d m a e m a 存在氨基提供一定的正电荷密度，保证载 体和d n a 的相互作用。他们利用自由基聚合得到不同比例和分子量的共聚物， 并考察了l c s t 、粒径和z e t a 电位。在2 5 时共聚物能够与d n a 结合。光散射 实验显示，由于共聚物l c s t 降低，复合物中的共聚物可能形成沉淀。随着共聚 物中n i p a a m 含量的增加，形成直径2 0 0 n m 复合物时，共聚物与质粒的比例也 在增加，但与分子量无关。增加共聚物中n i p a a m 的含量，复合物的细胞毒性 明显降低，这说明n i p a a m 对于d m a e m a 的细胞毒性有明显的屏蔽效应。他 们的结果显示高分子量的共聚物对卵巢癌细胞的转染效果较好，但未能得出聚合 物的l c s t 和转染之间的相关性。 k u r i s a w a t “) 的研究小组将疏水单元甲基丙烯酸丁酯( b m a ) 引入到 p n i p a a m c o d m a e m a 体系，形成三元共聚物。并在不同的条件下研究了其对 非洲猴的肾细胞( c o s 1 ) 的体外转染情况。由于同时存在d m a e m a 和b m a ，其 复合物的水溶性取决于解离和疏水部分的相互作用。为了研究温度对复合物形成 解离的影响，研究人员对载体比例为8 1 ：8 ：i l ( n i p a a m ：d m a e m a ：b m a ) 的共聚物的l c s t 进行测试，得到相转变温度为2 l ，并对其复合物的转变温 度进行了考察，发现复合d n a 不影响l c s t 的变化。同时研究其不同温度下与i ) n a 的相互作用：在低于l c s t 条件下，该复合物有局部的解离；高于l c s t 的条件下 未发现解离情况。在考察其转染效率的实验中，发现载体比例为8 l ：8 ：1 1 ( n i p a a m ：d m a e m a ：b m a ) 的共聚物的转染效率明显高于载体比例为9 l ： 9 ( n i p a a m ：d m a e m a ) 的共聚物。为了考察温度对转染的影响，选择了两条 转染路线：3 7 ，4 7 h 和3 7 ，2 0 h - - 2 0 ，3 h 一3 7 ，2 4 h 。对于不同的转染路 线来说，不含n i p a a m 的共聚物在两种条件下的转染效率相当；三元共聚物的 变温培养的转染效率比恒温培养的转染效率高，甚至将恒温培养路线的细胞培养 更长的时间也未发现其转染效率优于变温培养的细胞( 如图l 一7 所示) 。在此后 对另外两种不同组成比例的该三元共聚物的转染实验”中发现，在更高的温度 ( 3 7 和4 5 ) 进行复合得到的复合物比在室温条件下得到的复合物的转染效 率更高，因此研究人员提出了一个新的观点：温度控制的基因的表达对于未来的 基因治疗是非常重要的。 t w a i t c s 等人合成了一系列聚阳离子高聚物，包括支化p e i 接枝辛胺，p e i 第一章绪论 共聚n i p a a m 和n i p a a m - - c o - - d m a e m a - - c o - - h a ( 己基丙烯酸) 。所有聚合物 都可以溶于p b s ( p h = 7 4 ) ，但只有p e i 共聚n i p a a m 和n i p a a m c 0 一 d m a e m a - - c o - - h a ( 己基丙烯酸) 存在温敏性。通过荧光光谱、琼脂糖凝胶电泳、 动态光散射和原子力显微镜对载体和d n a 的相互作用进行考察，发现载体的相 转交行为对复合物的复合趋势的影响不是特别明显，但温度提高使粒径变大，从 3 0 - - 7 0 r i m ( 2 5 ) 到6 0 - - 1 0 0 r a n ( 3 7 ) 。对于n i p a a m - - c o - - d m a e m a - - c o h a 来说，低于l c s t 的温度形成更稳定的复合物，在升高温度条件下复合物 的尺寸随着电荷比的不同而不同，这说明发生在复合物形成后的聚合物的相转变 同样能改变复合物的结构。所有的聚合物的尺寸在相转变温度时都变大，高于 l c s t 时又减小。初步的转染实验的结果表明，实验中的所有载体都具有将质粒 d n a 运送到细胞核的能力，但温度敏感载体在小鼠的肌细胞( c 2 c 1 2 ) 中的蛋 白表达水平较低。所有的实验结果揭示，合成有适当官能团和分子结构的温敏性 聚合物对于复合物形成过程的可逆性、细胞的吸收和转染效率的提高都有着重要 的作用。 图1 7p d m a e m a 和n i p a a m - - c o - - d m a e m a - - c o - - b m a 三元共聚物的转染效 率，( a ) 为p d m a e m a ，( b ) 载体比例为8 l ：8 ：i i ( n i p a a m ：d m a e m a ：b m a ) 1 4 (u孽基害墨c乏 富薹2ae毫薹一 盖薹鼍譬里蔓莒皇晨v点皇i薯皇墨鼍置叠童墨x 第一章绪论 p i s k i n 课题组将羧基封端的p n i p a a m 与分子量2 k d a 的p e i 反应，制得 p e i 基温度响应非病毒载体。由于p n i p a a m 链上引入了p e i ，使得共聚物的l c s t 升高到3 7 左右，z e t a 电位比相应的p e i 均聚物降低了许多。复合物的z e t a 电 位在3 1 到+ 2 1 3 之间，当使用支化的高分子量p e i 制备共聚物时，可以得到更 高z e t a 电位的复合物。复合物的粒径在1 9 0 - - 9 9 2 n m 之间变化。细胞毒性实验同 样证明了加入p n i p a a m 降低了p e i 的细胞毒性，共聚物对于原代细胞的转染高 于细胞系。通过实验条件的改变得到了以下的结论：尺寸在2 0 0 - - 3 0 0 r i m 左右， 正电荷密度在1 0 - - 1 4 m v 的复合物可以得到较高的转染效率，虽然支化p e i 的转 染效率高于线性p e i ，但是其较高的细胞毒性限制其作为非病毒载体的应用。 1 2 3 2 5 光敏性载体 n a g a s a k i 等人合成一种新型的水溶性末端为l 一赖氨酸的聚偶氮苯的树状 高分子，通过光散射实验和凝胶渗透色谱实验发现该高聚物和质粒d n a 形成的 复合物的尺寸是紫外光( u v ) 和可见光可调节的。初步的体外转染实验显示u v 照射有利于进入胞浆中的复合物的解离，并使转染效率提高5 0 左右。同时 n a g a s a k i 等人还研究了一种含有光异构偶氮苯结构和赖氨酸残基的脂质体作为 基因载体的可能性，转染实验结果证实其在u v 照射下的转染效率高于