（分析化学专业论文）卷烟烟气中烟草特有亚硝胺的净化与分析新技术研究.pdf

中国科学技术大学硕士学位论文摘要 摘要 烟草特有亚硝胺( t s n a s ) 是卷烟烟气中诱发癌症的主要活性成分之一，包 括n 亚硝基降烟碱( m 州) 、4 一甲基亚硝基吡啶基丁酮( n n k ) 、n 亚硝基新 烟草碱( n a t ) 和n 亚硝基假木贼碱( n a b ) 等。人们长期对灵长类和啮齿类 动物体内和体外研究试验，发现n n n 和n n k 在代谢过程中产生的亲电中间体 与d n a 和血红蛋白形成共价化合物，沾覆在啮齿动物的鼻腔黏膜、肝肺等组织 中，诱导组织癌变。随着吸烟与健康问题研究的深入，准确测量和客观披露卷烟 烟气中的t s n a s 生成量将具有重要意义。 本文在广泛的文献调研和实验研究的基础上，采用液相色谱与三重四极杆质 谱联用技术评价适合净化卷烟烟气中烟草特有亚硝胺的商品化固相萃取柱，通过 比较c 1 8 、碱性氧化铝、阳离子交换柱填料，优选出合适的固相萃取柱，并优化 该萃取柱的上样、淋洗、洗脱以及柱容量等条件。实验优选出具有反相保留和阳 离子交换功能双重保留机理的p c x 固相萃取柱，上样穿透率以及淋洗回收率小 于2 、洗脱回收率大于9 6 。通过比较经过净化和未经过净化样品的总离子流 图以及四种t s n a s 的峰面积，得出该净化过程可以部分消除样品基体干扰，为 准确测定卷烟烟气中t s n a s 提供技术支撑。 本文基于超高效液相色谱与质谱联用法( u p l c m s m s ) 分析检测卷烟烟气 粒相物中的t s n a s ，首次建立了超高效液相色谱技术上基线分离、多反应离子监 测质谱技术上快速检测t s n a s 的新技术。采用同位素稀释法降低基体背景干扰， 并通过在t s n a s 标样中分别添加1 0 倍、1 0 0 倍、1 0 0 0 倍酸性物质柠檬酸、碱性物 质尼古丁、中性物质胡萝卜素考察离子抑制问题。测定结果准确性判断是通过加 标回收、测定标准卷烟样品以及与现行标准方法对照：在实际样品中加入标准物 质，n n n 、n n k 、n a t 、n a b 的回收率均大于8 9 ，精密度( r s d ) 皆小于1 0 ( n - 5 ) ；采用本方法测定2 0 0 3 肯塔基2 r 4 f 标准烟，结果与标准品约定真值的相 对误差均小于2 0 ；通过测定7 组混合型和8 组烤烟型卷烟，并与行业标准方法 ( g c t e a ) 测定结果相比较，两种分析方法对于烤烟型卷烟中t s n a s 测定结果 的绝对误差在1 5 n g 以内；对于混合型卷烟中t s n a s 含量，使用u p l c m s m s 法 中国科学技术大学硕士学位论文摘要 测得t s n a s 含量明显低于g c t e a 法，相对误差在1 5 以内。u p l c m s m s 方法 的优越性主要体现在分析速度快、灵敏度高、回收率高，仪器通用性强，为解决 我国卷烟烟气中t s n a s 分析方法的技术壁垒提供了可靠的技术基础。 本论文首次研究了超高效液相色谱与飞行时间质谱联用法( u p l c - t o f m s ) 测定卷烟烟气中t s n a s 的分析方法，通过优化了色谱与质谱条件，使四种t s n a s 基线分离，通过准确提取分子量定性和内标法定量，结果表明该方法线性关系良 好，相关系数大于0 9 9 ，加标回收率在7 7 一l1 2 之间；测定2 0 0 3 肯塔基2 r 4 f 标准卷烟的结果与g c t e a 法测定结果的相对误差小于2 0 。u p l c t o f m s 分 析速度快，仪器通用性强，可以作为测定烟草及卷烟烟气中t s n a s 的辅助方法。 关键词：t s n a su p l c m s m su p l c t o f m s固相萃取主流烟气 i l 中国科学技术大学硕士学位论文a b s t r a c t a b s t r a c t t o b a c c os p e c i f i cn i t r o s a m i n e s ( t s n a s ) h a v eb e e ni d e n t i f i e di nb o t ht o b a c c o sa n d c i g a r e t t es m o k ea n da r ew i d e l ya d m i t t e da so n eo ft h em a i ng r o u p sl e a d i n gt oc a u s e c a n c e ra n ds o m er e l a t e dp r e v e n t a b l ed i s e a s e f o u ro ft h em o s tc o m m o n l y a n a l y z e d t s n a s c o m p o u n d s a r e n n i t r o s o n o r n i c o t i n e ( n n n ) ， 4 一( n m e t h y l n i t r o s a m i n o ) - 1 一( 3 一p y r i d y l ) 一1 - b u t a n o n e ( n n k ) ，n - n i t r o s o a n a t a b i n e ( n a d ，n n i t r o s o a n a b a s i n e ( n a b ) a c c o r d i n gt ot h ei n t e r n a t i o n a la g e n c yf o r r e s e a r c ho nc a n c e r ，n n na n dn n ka r et h es t r o n g e s ta n i m a lc a r c i n o g e n sa m o n g t h et s n a s ，n a bi sr e l a t i v e l yw e a kc a r c i n o g e n i c ，a n dn a ti si n a c t i v ei nt h e r o d e n t ss t u d y t h em e t a b o l i t eo fn n na n dn n ka r et h o u g h tt ob ep a r t i c u l a r l y i m p o r t a n ti nt h ei n d u c t i o no fa d e n o c a r c i n o m a , l u n gc a n c e ra n dl i v e rc a n c e ri n r o d e n t sa n dq u a d r u m a n a s w i t ht h eh o tr e s e a r c ho ft h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e n s m o k i n ga n dh e a l t h ，i ti sq u i t es i g n i f i c a t i v et oi d e n t i f ya n dd e t e r m i n et h ey i e l do f t s n a sd u r i n gs m o k i n g i nt h ep r e s e n tp a p e r , as e r i e so fp u r i f i c a t i o ns t e p sw a sb u i l tt oe v a l u a t et s n a si n c i g a r e t t es m o k eb yu p l c - m s m s a sd i f f e r e n tr e t e n t i v ec h a r a c t e r so ft s n a so nc 1 8 ， b a s e a 1 2 0 3a n di o n - 。e x c h a n g ec o l u n mp a d d i n gr e s p e c t i v e l y , t h em o s tl i k e l yp a d d i n g w a ss e l e c t e db yc o n s i d e r i n gl o a d i n g ，w a s h i n ga n de l u t i n gp r o c e d u r e so fs o l i dp h a s e e x t r a c t i o n ，a n de a c hs t e pw a so p t i m i z e d am i x e d m o d ec a t i o n - e x c h a n g es o l i dp h a s e c o l u m nn a m e dp c xw a ss e l e c t e dt op u d f yt h et s n a si nm a i n s t r e a ms m o k es a m p l e s w i t ht h el o a d i n gp e n e t r a t i o na n dw a s h i n gr e c o v e r yl e s st h a n2 ，e l u t i n gr e c o v e r y m o r et h a n9 6 i tw a sc l e a r l yd e m o n s t r a t e dt h a tc l e a n - u ps t e pw a se s s e n t i a lb y c o m p a r i n gt o t a li o nc h r o m a t o g r a m sa n ds p e c i a lp e a ka r e a so ft s n a si ns a m es a m p l e s p u r i f i e do rn o t a l s oi nt h i sp a p e r an e wm e t h o d ，b yu l t r a - p e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y t a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r yf o rt h ed e t e r m i n a t i o no ft s n a si nc i g a r e t t es m o k ew a s f i r s te s t a b l i s h e di nc h i n ao nt h eb a s i so fe x t e n s i v el i t e r a t u r e i n v e s t i g a t i o na n d e x p e r i m e n t a lr e s e a r c h t h i sn e wt e c h n o l o g yw a sg r o u n do np u r i f i c a t i o nb ys o l i d p h a s ee x t r a c t i o n ，t h ei s o t o p i c a l l yl a b e l e da n a l o g u e s ( i s ) i e ，n n n d 4 ，n n k d 4 ， n a t - d 4 ，n a b d 4 ，h i g hr e s o l u t i o no nu p l ca n dm u l t i p l er e a c t i o nm o n i t o r i n go n m a s s m a t r i xe f f e c tw a sa l s od i s c u s s e db ya d d i n g10 ，10 0 ，10 0 0 m u l t i p l ea c i d ( c i t r i c a c i d ) ，b a s e ( n i c o t i n e ) a n dn e u t r a lm a t e r i a l s ( c a r o t e n e ) t ot s n a ss t a n d a r d st oe v a l u a t e 1 1 1 中国科学技术大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h ei o ns u p p r e s s i o nr a t e si nr e a lm a i n s t r e a ms a m p l e s t h i sm e t h o dw a sv a l i d a t e db y t h r e ew a y s ：t h i su p l c m s m sm e t h o dw a sa p p l i e dt od e t e r m i n et s n a si n2 0 0 3 k e n t u c k y2 r 4 fr e f e r e n c ec i g a r e t t e ，a n dt h er e l a t i v e e r r o rw a sl e s st h a n2 0 r e s p e c t i v e l y ；t h i su p l c m s m sm e t h o dw a sc o m p a r e dw i t i lt h es t a n d a r dg c t e a m e t h o dt h r o u g hd e t e r m i n i n gf i f t e e nd i f f e r e n ts a m p l e s ，a n dt h er e l a t i v ee r r o rw a sl e s s t h a n15 ；r e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n s ( n = 5 ) a n dr e c o v e r i e so fn n n ，n n k ，n a t , n a bw a so b t a i n e db ya d d i n gs t a n d a r dt s n a si n t om a i n s t r e a ms m o k es a m p l e s ，w i t h r s db e l o w10 ，r e c o v e r ym o r et h a n8 9 ，r e s p e c t i v e l y t h i sm e t h o di sf a i r l yn o t a b l e o nf a s ta n a l y z i n gs p e e d ，h i 曲s e n s i t i v i t y , a n dt h eu n i v e r s a lu s eo ft h ee q u i p m e n tw h i c h i sa p p l y i n gad e p e n d a b l eb a s i so nd e t e c t i n gt s n a si nc i g a r e t t es m o k ei nc h i n a i nt h el a t t e r p a r to ft h i sp a p e r , a nu l t r a p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y c o m b i n e dw i t ht i m e - o f - f l i g h tm a s ss p e c t r o m e t r y ( u p l c - t o f m s ) m e t h o dh a d b e e nf i r s t l ya p p l i e df o rs c r e e n i n ga n dq u a n t i f i c a t i o no ff o u rt o b a c c o s p e c i f i c n i t r o s a m i n e s ( t s n a s ) i nm a i n s t r e a mc i g a r e t t es m o k e f r o mt h ea c q u i r e df u l l s c a nd a t at h et s n a si o n sw e r ee x t r a c t e df o rc o n s t r u c t i o no ft h ec h r o m a t o g r a m s a n de v a l u a t i o no ft h er e s u l t s t h es t a n d a r dc u r v e sf o rn n n ，n n k ，n a t ，n a b w e r el i n e a rw i t ht h ec o r r e l a t i o nc o e 伍c i e n t sa b o v e0 。9 9i nt h ec o n c e n t r a t i o n r a n g e so f0 10 0n g m l ，o b t a i n e db yp l o r i n gt h ep e a ka r e ar a t i o so ft h ea n a l y t e s r e l a t i v et ot h ei s o t o p i c a l l yl a b e l e da n a l o g u e s ( i s ) ，i e ，n n n - d 4 ，n n k d 4 ， n a t - d 4 ，n a b d 4 f u r t h e r m o r e ，t h el i m i t so fq u a n t i f i c a t i o n ( l o q ) w e r eb e t w e e n o 9 7a n d3 0 9n g m l ( s n = 10 ) t h ep r o p o s e dm e t h o dw a sv a l i d a t e df o rt h e p r e c i s e ，e f f i c i e n ta n dr a p i ds c r e e n i n ga n dq u a n t i f i c a t i o no ft s n a si nm a i n s t r e a m c i g a r e t t es m o k e k e y w o r d s ：t s n a s ，u p l c m s m s ，u p l c t o f m s ，s p e ，m a i n s t r e a ms m o k e w 中国科学技术大学学位论文原创性声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的成 果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何他人已经发表或撰写 过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了明确 的说明。 作者签名：棒 中国科学技术大学学位论文授权使用声明 作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者授权中国科学技术大学拥 有学位论文的部分使用权，即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交 论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入中国学 位论文全文数据库等有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存、汇编学位论文。本人提交的电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 刊公开 作者签名： 口保密( 年) 华墨骛 导师签名： 签字e t 期：丛! ! ：墨：垒 中国科学技术大学硕士学位论文第一章 第一章烟草及烟气中t s n a s 分析方法的研究进展 1 1 引言 烟草是一种重要的经济作物，原产于美洲，是消费品和税收的重要来源( 张 家伟，2 0 0 1 ) 。大约在4 0 0 年前传入中国，我国目前烟草种植的总面积、总产量 和卷烟生产量均居世界首位，对世界烟草有着举足轻重的影响( 金闻博等， 2 0 0 4 ) 。烟草是一种特殊的食品，虽然不能满足人们对饱腹和营养的基本要求， 但吸食烟草制品可以使人得到精神层面上的满足，因此，随着烟草行业的不断发 展，烟草充溢着世界的每个角落，烟草制品已经成为全球数亿人的嗜好品。 烟草的化学成分复杂，与烟草的类型、栽培、调制、加工等有相当密切的关 系( p e e l ee ta l ，1 9 9 5 ；黄镇等，1 9 9 9 ) 。1 9 8 2 年l o 月召开的第3 6 届美国烟草化 学研究工作者会议( t c r cc o n v i n c e ) 的评述中报道，烟气和烟草中都存在的 化学成分有1 1 3 5 种，只在烟草中存在的化学成分有1 4 1 5 种，只在烟气中存在的 化学成分2 7 4 0 种，共计5 2 9 0 种。卷烟在高温条件下被燃吸时，烟支内部化学 成分发生热分解、热转化、热合成等一系列化学物理变化，生成很多新物质，导 致卷烟烟气中的化学成分更加复杂。卷烟烟气中存在着焦油、烟碱、一氧化碳、 稠环芳烃、挥发性醛类、氢氰酸、亚硝胺( b r u n n e m a n ne ta l ，1 9 9 1 ) 等多种不利 于人类健康的致癌物质( r o d g m me ta l ，2 0 0 2 ) 。到目前为止，国际上已经有数万 项关于吸烟与健康方面的科学研究成果，对部分严重致癌的物质进行大量关于病 理学、生理学( a d a m se ta l ，1 9 8 5 ) 、形态学、药理学和流行病学等的研究，已经 取得了阶段性的成果，为进一步开展降低卷烟烟气中有害成分的研究奠定了一定 的基础。随着人民生活水平的提高和吸烟与健康问题研究的日益深入，人们对烟 草制品提出“低毒、安全 等新要求，对烟草行业提出新的挑战和压力。2 0 0 5 年8 月2 8 日烟草控制框架公约在我国正式生效，烟草行业面临“吸烟与健 康问题 的压力进一步加强，烟草控制框架公约中关于“烟草成份管制与披 露”准则的要求将使各国政府制定出相应的管制法规，更加严格地限制卷烟制品 中有害成分( h o f f m a n n 分析物) 释放量( r e n a u d e ta l ，2 0 0 1 ) ，同时，为了发 展低危害卷烟产品，企业也需要一个客观准确的评价标准，这些因素就要求烟草 中国科学技术大学硕士学位论文第一章 行业必须建立准确可靠的卷烟烟气中有害成分标准分析方法。我国烟草行业现阶 段科技创新重点在于“减害降焦”进一步降低卷烟焦油量，并选择性地减少 或者消除卷烟烟气中的有害成分，提高吸食烟草的安全性。这一举措，符合未来 烟草发展的要求，具有战略性的意义( 谢笑天等，2 0 0 2 ；郑新章等，2 0 0 3 ) 。 国际癌症协会( 1 a r c ) 定义烟草及烟气中有4 4 种物质为已知致癌物，其中 烟草特有亚硝胺( t s n a s ) 是最关注的强烈致癌物质种类之一( f i s c h e re ta l ， 1 9 9 0 ) 。烟草特有亚硝胺主要有7 种，分别为n 一亚硝基去甲烟碱( 卜涂n ) 、4 ( 甲 基亚硝胺基) 。1 ( 3 一吡啶基) 1 丁酮( n n k ) 、n 亚硝基新烟碱( n a t ) n 亚 硝基假木贼碱( n a b ) 、4 ( 甲基亚硝胺基) 1 ( 3 吡啶基) 1 丁醇( n n a l ) 、 4 ( 甲基亚硝胺基) - 4 ( 3 一吡啶基) 1 一丁醇( i s o - n n a l ) 、4 ( 甲基亚硝胺基) 4 ( 3 吡啶基) 1 丁酸( n n a c ) 、4 ( 甲基亚硝胺基) 4 ( 3 吡啶基) 1 丁醛 ( n n a ) 。国际癌症研究机构( 1 9 8 6 ) 在动物实验中有足够的病理学研究等证据 的情况下认为n n k ( b r u n n e m a n ne ta l ，1 9 8 7 ) 和n n n 对人体的致癌性等级为 g r o u p l ( 人体致癌物) ，n a t 和n a b 对人体的致癌性尚不明确( b o y l a n de ta l ， 1 9 6 5 a ) ，认为其致癌性等级为g r o u p 3 ( 怀疑的致癌物) ( b o y l a n de ta l ，1 9 6 4 c ) ， n n a l 、i s o - n n a l 、n n a c 、n n a 的致癌性等级没有规定。因此，对n n n 、n n k 、 n a t 、n a b 的研究比较深入( c h e p i g ae ta l ，2 0 0 0 ) ，其结构式如图l 所示。人们 经过长期对灵长类和啮齿类动物进行体内和体外试验的研究( a t a l l ae ta l ，1 9 9 9 ； h e c h t ，1 9 9 9 a ) ，发现n n n 和n n k 在代谢过程中产生的亲电中间体与d n a 和血 红蛋白形成共价化合物( c a r m e l l ae ta l ，1 9 8 7 1c a r m e l l ae ta l ，1 9 9 2 ) ，沾覆在啮齿 动物的鼻腔黏膜、肝肺( b o y l a n de ta l ，1 9 6 4 b ；c h u n ge ta l ，1 9 9 2 ) 等组织中，诱 导组织癌变( b e l i n s k ye ta l ，1 9 8 7 ) 。 n n n o o o i i n l n n n k n a tn a b 图1 n n n 、n n k 、n a t 、n a b 的结构式 f i g 1s t r u c t u r e so f n n n ，n n k ，n a t , n a b 2 中国科学技术大学硕士学位论文第一章 n i c o t i n e 3 n o r n i c o t i n e a r l a t a b i n e a n a b a s i n e o n n n n a t 图2 烟气中t s n a s 的前体物和形成机理 o i i n i n n a b f i g 2a l k a l o i dp r e c u r s o r sa n df o r m a t i o nm e c h a n i s m so f t s n a si nt o b a c c os m o k e 烟草特有亚硝胺是由仲胺和叔胺与硝酸盐或者氮氧化物反应生成的( a r c h e r e ta l ，1 9 7 6 ：b u r t o ne ta l ，1 9 9 4 ) ，烟草制品中含量最丰富的叔胺是尼古丁( c a l d w e l l e ta l ，1 9 9 1 ) ，在烟草加工( 主要是烘烤和发酵) ( c h a m b e r l a i ne ta l ，19 9 2 ) 、燃吸 和人体吸入的瞬间生成n n n 和n n k 等( a d a m se ta l ，1 9 8 3 ) ；同时含量稍低的 次要生物碱降烟碱、假木贼碱、新烟碱也生成n n n 、n a t 和n a b ( f i s c h e re ta l 。 1 9 9 0 b ；h e c h te ta l ，1 9 9 9 h ) ，如图2 所示。在用1 3 c 标记n n n 和n n k 的研究中 证明，n n k 从烟草中转移到烟气中的比例占总量的6 9 1 1 o ，n n n 的转移比 例为3 0 左右，而其余是在高温燃吸过程中热解合成( a l l e ne ta l ，1 9 7 5 ；d j i o r d j e v i c e ta l ，1 9 8 6 ) 。烟草或烟气中的亚硝胺含量极微，一般在l o 西克克或l o 。9 克克， 烟草和烟气背景及其复杂，测定干扰相当严重，因此对烟草特有亚硝胺的准确定 量有较大难度。 卷烟烟气中烟草特有亚硝胺的分析检测步骤主要有以下四个部分组成：从卷 中国科学技术火学硕士学位论文第一章 烟烟气中捕集；从捕集装置中提取；进一步分离净化提取液；最后用仪器方法对 t s n a s 进行定性定量检测。随着现代分析技术的迅速发展，使得烟草特有亚硝 胺的分析方法在分析速度、灵敏度和准确性上有了很大提高。提取方式主要有机 械振荡、超声提取和超临界流体提取；净化过程主要包括液液萃取技术、手工 装填柱层析技术和商品化固相萃取小柱技术等；仪器分析技术更迭比较快，主要 有分光光度法( 沈彬等，1 9 9 8 ) 、液相色谱法( h e c h te ta l ，1 9 7 5 ) 、气相色谱法( 赵 明月等，2 0 0 0 ) 、以及气相色谱与氮磷检测器联用法( 刘万峰等，2 0 0 3 ) 、气相 色谱与热能分析仪联用法( i d n ae ta l ，2 0 0 2 ；李文寿，2 0 0 7 ) 、气相色谱与质谱联 用法( z h o ue ta l ，2 0 0 7 ) 、毛细管电泳与质谱联用法( l ie ta 1 ，2 0 0 6 ) 、液相色谱与 三重四极杆质谱联用法( k a r le ta l ，2 0 0 5 ) 等方法。本文主要研究了烟草特有亚 硝胺的提取、净化以及仪器分析过程，选取适当的提取方式、合适的净化过程和 快速灵敏的分析技术，准确测定卷烟烟气中烟草特有亚硝胺。 1 2 烟草及烟气中t s n a s 的提取技术 1 2 1 超声提取方式 超声提取是最常见的提取方式，可以进行复杂样品中低含量目标物的提取， 提取效率比较高。实验室使用的超声萃取仪主要原理是：由超声波换能器产生的 超声波不会使样品内的分子产生极化，而是在溶剂和样品间产生声波的空化作 用，导致溶液中的微小气泡核被激活、振荡、生长，空化泡在极短时间内产生局 部高温、高压和强大冲击波，使细胞组织变形、破裂，加快相间的传质速度，从 而加速目标成分进入溶剂( 张斌等，2 0 0 8 ) 。另外，超声波的热作用和机械作用 也能强化超声波萃取。超声提取技术具有操作简单、时间短、安全性好等优点， 在样品前处理中应用十分广泛，如在土壤中提取多残留农药，在蔬菜中提取微量 元素，在中药材中提取活性成分等( 倪网东，2 0 0 5 ) 。 通过优化超声提取的相关系数( 溶剂种类、溶剂体积和提取时间等) ，可以 用于提取烟草及卷烟烟气中烟草特有亚硝胺。对于不同的样品基体成分，提取液 有很大的不同，例如，蔬菜水果的农药多残留一般采用乙酸乙酯，食品中目标物 的提取使用的是二氯甲烷比较多( l ie ta l ，2 0 0 4 ) ，烟气或者烟叶中t s n a s 的提 取液一般采用缓冲溶液，超声提取时间也会对t s n a s 的含量有影响，时间过短 4 中国科学技术大学硕上学位论文 第一章 可能导致t s n a s 萃取不完全，时间过长可能导致缓冲液中水分子发生分解，生 成大量的氢氧根自由基，从而氧化分解萃取出的t s n a s ( 刘万峰等2 0 0 3 ；黄 群腾，2 0 0 8 ) 。 1 2 2 机械振荡方式 机械振动是一种比较常见的提取技术，主要是通过在一定的振荡频率下破坏 目标物与基体之间力的作用，从而达到从复杂样品中提取低含量目标物的目的。 机械振荡方式完全凭借外力作用，操作简单，安全性好，在提取过程中不会导致 目标物分解，应用十分广泛，一般用于土壤中农药多残留的提取等( 陈丽，2 0 0 6 ) 。 通过优化机械振动参数( 溶剂种类、溶剂体积、提取时间等) 可以用于提取 烟草及烟气中的烟草特有亚硝胺。其作用机理虽然与超声提取方式不同，但提取 溶剂、提取时间的优化与超声方式相同，对于烟叶中t s n a s 的提取，两种方式提 取效果相同。赵明月等提出两种方法结果相近，但超声萃取的时间要短的多( 赵 明月等，2 0 0 0 ) 。 1 2 3 超临界流体萃取方式 超临界流体萃取( s u p e r c r i t i c a lf l u i d se x t r a c t i o n ，s f e ) 是8 0 年代发展起来的 利用超临界流体特性的提取分离技术。超临界流体( s c f ) 是介于气体和液体之 间的流体，与液相的密度、气相的粘度及高的扩散系数相接近，故具有很高的溶 解能力、良好的流动、传递以及渗透性能，被称为“绿色分离技术”。最常用的超 临界流体是c 0 2 ，s c f c 0 2 临界温度为3 1 3 c ，可在常温下操作，对大部分物质 呈化学惰性，无色无毒，价廉易得，不易燃烧，通过调节温度和压力针对性地提 取有效成分等优点，已经引起国内外学者的关注，应用范围十分广阔。如在医药 工业中，中草药中生物活性分子、生物碱的提取，不同微生物脂质类混合物的分 离；香料工业中，天然及合成香料的精制；食品工业中，啤酒花的提取，色素的 提取等( w u e ta l ，2 0 0 1 ) 。 超临界流体萃取技术可用于提取烟草和卷烟烟气中烟草特有亚硝胺( s o n ge t a l ，1 9 9 9 ) ，但由于s c f c 0 2 极性小，需在提取时加入调节剂，或采用超声辅助加 强超临界萃取( b a l a c h a n d r a ne ta l ，2 0 0 6 ) ，改善其选择性的同时提高烟草特有亚 硝胺的溶解度，如在二氧化碳中加入极性比较强的甲醇，可以提高极性成分的提 取效率。有文献报道使用超临界流体萃取方式与其他液体萃取方式萃取烟草特有 中国科学技术大学硕士学位论文第一蕈 亚硝胺的效果相差不大，但由于s f e 装置比起其他两种萃取方式的装置要复杂的 多，所以后来很少有人采用该方式提取t s n a s 。 1 3 烟草及烟气中t s n a s 的分离净化技术 1 3 1 液一液萃取( l l e ) 净化方式 液一液萃取技术是传统的净化方式，常用于样品中待测物质与基质的分离， 通过待测物质和基质背景在两种不相溶液体或相之间分配比的不同进行分离，从 而达到纯化和消除干扰物质的目的。早期有采用液液萃取方式来净化卷烟烟气 中t s n a s ( k l i m i s c he ta l ，1 9 7 6 ) ，通过具有较高蒸气压的溶剂提取，以蒸发的方 式将溶剂除去，达到分离和富集待测物质。液液反萃技术具有方法稳定、成本 低等优点，但也存在一些不足之处，如操作复杂导致回收率偏低，容易乳化，有 机溶剂用量较大易对人体和环境造成二次污染等，因此渐渐被固相萃取、固相微 萃取等技术所取代c 支l j d 燕，2 0 0 9 ) 。 1 3 2 固相萃取( s p e ) 净化方式 固相萃取是由液固萃取和柱液相色谱技术发展而来，是一个柱色谱分离过 程，其分离机理、固定相、淋洗溶剂和洗脱溶剂的选择与液相色谱柱有许多相似 之处。固相萃取技术与液一液萃取技术也有很多相似之处，其目的都是使待测物 质在两相之间达到分离。1 9 7 8 年出现的一次性商品化s p e 柱极大地拓展了固相 萃取技术的应用领域，渐渐取代传统的l l e 技术。与l l e 技术相比，固相萃取技 术有如下优点：回收率高、净化效率高、有机溶剂消耗低、能小体积操作、易于 实现批量处理等( 张海霞等，2 0 0 0 ) 。 固相萃取技术自身的特点决定其成为使用比较多的净化手段，前期是手工装 填的层析柱，后期为商品化的固相萃取小柱，尤其是一次性使用的商品化s p e 更是扩大了固相萃取技术的应用范围。一般手工装填的层析柱具有比较大的柱容 量，可以使目标组分从基体中分离，达到净化的目的，但手工装填柱存在比较大 的缺陷：对于含量极低的目标成分实验重复性较差，不同人员、不同批次装填的 填料紧密程度也会存在很大差异，直接导致了分析结果的不稳定。早期有使用手 工装填的层析柱来净化烟草及烟气中烟草特有亚硝胺( c h o k r t y ke ta l ，1 9 9 1 ) 。 6 中国科学技术大学硕士学位论文第一章 由于手工装填柱存在上述缺陷，商品化萃取小柱逐渐成为复杂基体样品净化 的主流方式。商品化固相萃取柱经过机械化装填和特定的处理，同批次问操作误 差比较小，但其填料少，柱容量比较低。s p e 柱填料本质上与液相色谱柱的填料 相似，只是填料颗粒粒径比色谱柱的大，使用比较多的是疏水性填料，在水相中 对大多数有机物都有保留效果。近年来，具有不同选择性和保留机理填料的使用 也越来越广泛，如氨基、苯基、双醇填料，活性炭、氧化铝、硅酸镁填料，聚合 物、聚合物键合离子交换填料等( 丁彦彬等，2 0 0 8 ) ，使s p e 一直以1 0 的年增 长率扩大其应用。 大量文献报道使用不同柱材料的商品化固相萃取小柱净化卷烟烟气中 t s a n s ，从而降低背景干扰。主要有以下几类，e n v i c a r b 吸附型固相萃取柱， 保留机理主要是吸附作用( z h o ue ta l ，2 0 0 7 ) ；硅胶键合c 1 8 萃取柱，主要是反 相保留机理( l ie ta l ，2 0 0 6 ) ；水可浸润型h l b 材料的固相萃取柱( 、ue ta l ， 2 0 0 8 ) ，是酸性、碱性和中性化合物的通用型吸附剂。以水可浸润型聚合物为基 质的阳离子交换和反相混合机理的固相萃取柱可以专用于净化碱性物质，进一步 消除中性和酸性物质的干扰，在大比表面积的有机共聚物上具有比较大的结合容 量，可以用来净化卷烟烟气中t s n a s ( 李勇等，2 0 0 8 ) 。 1 3 3 固相微萃取；争化方式( s p m e ) s p m e 是一种简单、快速、灵活、无溶剂的样品前处理技术，一般都是在熔 融二氧化硅纤维上涂敷一层可作为合适萃取相的薄膜，实现在线和自动浓缩分 析，理论上可以达到最大吸附量的吸附平衡。自从1 9 8 9 年b e l a r d i 和p a w l i s z y n 首次提出固相微萃取技术以来，商品化s p m e 装置以及联用装置的推出极大地 拓展了s p m e 的应用领域( 刘百战等，2 0 0 2 ) ，可以集富集、净化、进样于 体，具有操作简便，灵敏度高，不容易产生二次污染等优点。有文献报道采用 s p m e 与h p l c 联用技术可以净化和检测烟草特有亚硝胺( m u l l e t te ta l ，2 0 0 2 ) ， 但由于h p l c 采用的是二极管阵列检测器( d a d ) ，检出限在微克级别，因此对 烟气样品中总体含量较低的t s n a s 测定带来相当大的难度。若将液相色谱的流 动相换成挥发性的醋酸铵类水溶液，则可以直接与质谱联用，进一步提高灵敏度， 降低检出限，但由于接口技术等问题导致目前s p m e 与h p l c m s m s 联用的应 用还比较少。 7 中国科学技术大学硕士学位论文第一章 1 4 烟草及烟气中t s n a s 的分析测定方法 1 4 1 气相色谱一氮磷检测器法( g c - n p d ) 氮磷检测器( n p d ) 又称热离子化检侧器( t i d ) 是分析含n 、p 化合物的高灵敏 度、高选择性和宽线性范围的检测器，广泛用于环保、医药、临床、生物化学、 食品等领域( w a n ge ta l ，2 0 0 5 ；万益群等，2 0 0 9 ) 。1 9 7 4 年k o l b 采用不易挥发 的碳酸铷和二氧化硅烧结成硅酸铷珠，在冷氢焰中用电加热，挥发出激发态铷原 子，铷原子与火焰中各基团反应生成r b + ，r b + 被负极电离源吸收还原，火焰中各 基团获得电子成为负离子，形成基流，当含n 、p 化合物进人电离源的冷焰区， 生成稳定的c n 、p o 、p 0 2 电负性基团，从气化的铷原子上获得电子生成r b + 与负 离子c n 、p o 。、p 0 2 。负离子在正电位的收集极释放出一个电子，同时给出信号， r b + 又回到负电位的表面，被吸收还原，以维持电离源的长期使用，从而解决了 铷珠寿命短的缺点，使检测器的稳定性明显改进、灵敏度显著提高，背景基流从 1 0 母a 降至1 0 。1 3 a ，成为检侧氮、磷化合物的气相色谱专一检侧器。该方法用于检 测卷烟制品及烟气中的含有亚硝基的t s n a s ，这类文章在2 0 0 2 年之前报道很多。 但g c - n p d 的检测限在微克级别，一般只能用来测定t s n a s 含量比较高的烟叶或 者烟丝等样品( 刘万峰，2 0 0 3 ) 。 1 4 2 气相色谱与热能分析仪法( g c - t e a ) 1 9 7 5 年，热能分析仪( t e a ) 的出现是n 一亚硝胺技术上的一次重大突破( k r u u e ta 1 ，1 9 7 9 ；b e g u t t e re ta 1 ，1 9 8 5 ) ，与气相色谱联用后成为分析亚硝胺和亚硝酸酯 类化合物的特征检测器( a d a m sje ta l ，1 9 8 3 ) 。其基本原理是含有亚硝基类化合 物经气相色谱分离、热裂解器裂解后，其中n - n o 键被打断，产生亚硝酰基自由 基( n o ) ，经过冷阱进入消除反应室中被臭氧氧化，得到电子激发态的二氧化 氮( n 0 2 * ) ，处于激发态的二氧化氮不稳定，回到基态时发出特征辐射，通过灵 敏的光电倍增管检测发光强度，测定n 一亚硝基化合物的含量。从本质上来看， t e a 是化学发光检测器，灵敏度高，其原理如图3 所示。 但t e a 也有其局限性，它对含有亚硝基的所有物质都有信号响应，对共同流 出的亚硝胺类物质不能区分，而且样品前处理极其复杂和耗时；t e a 也是一种专 门的亚硝胺类检测器，专用性强，价格昂贵，维修护理等耗费多，般实验室很 8 中国科学技术大学硕士学位论文第一章 难配备，限制了t e a 的广泛应用