（遗传学专业论文）α淀粉酶基因bd5088的合成及其表达和酶学性质研究.pdf

摘要 a 一淀粉酶为内切型淀粉酶，能够以淀粉为底物，从淀粉内部水解l ，4 ad 葡萄糖苷键。 耐高温淀粉酶更广泛应用于淀粉加工、制糖、味精、酒精、啤酒、柠檬酸、纺织印染以 及其它发酵工业，具有巨大的经济价值。在使用时通常a 淀粉酶需要与糖化酶配合使用， 依次对淀粉原料进行液化和糖化处理，整个过程中控制浆液的p h 值是一个关键因素。 通常从磨坊出来的淀粉浆料自然p h 值为4 5 左右，而目前广泛应用的高温a 淀粉酶最 适p h 值为6 0 6 2 ，在p h 5 0 以下酶活性很低，而来源于黑曲霉的糖化酶作用最适p h 值为4 2 4 5 ，所以在淀粉液化和糖化过程中需要反复用酸碱调整p h 值，这样不仅提 高了浆液中的离子浓度，而且调节不当会产生大量的副产物，影响发酵效率，增加了后 续工艺的复杂程度。如果在生产工艺中使用耐酸性的高温淀粉酶则可以简化工业流程、 节省生产成本、减少环境污染，可在以淀粉为原料的发酵工业中发挥巨大作用。因此开 发一种最适p h 值与糖化酶最适p h 值相仿的高温酸性a 淀粉酶是耳前的研究热点。 2 0 0 2 年，r i c h a r d s o n 从环境微生物d n a 3 c 库中克隆到的一系列可能来源于一种嗜热 球菌属( t h e r m o c o c c u s ) 的高温酸性a 淀粉酶基因，并通过定向进化筛选到一个的高温 酸性a 淀粉酶的人工突变体b d 5 0 8 8 ，在荧光假单胞菌p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s 获得表达。 基因b d 5 0 8 8 全长1 3 1 1b p ，编码4 3 7 个氨基酸，蛋白质的理论分子量约4 8k d ，肽链上不存 在任何潜在n 连接糖基化位点。最适p h4 5 ，最适温度9 5 * ( 2 ，活性不依赖于c a 2 + 存在， 是一种高温酸性a 淀粉酶，其综合性质均优于其它野生型基因，具有较大的应用潜力。 为了能达到生产的目的，本研究利用d n a w o r k s 3 0 软件，按照巴斯德毕赤酵母 密码子的偏好性，将其密码子进行优化设计，设计用于p c r 合成b d 5 0 8 8 基因的引物， 通过两步p c r 法合成了b d 5 0 8 8 基因，分别将其与质粒p e t - 3 0 a 和p h b m 9 0 5 b 连接将 正确构建的重组质粒p e t - b d 5 0 8 8 转化大肠杆菌b l - 2 1 细胞，在i p t g 的诱导下，该基 因在大肠杆菌中得到了表达，s d s p a g e 分析表达产生的蛋白大约为4 8 k d ，与预计的a - 淀粉酶的大小相一致。表达产生的a 淀粉酶的最适反应温度为8 0 。c ，在1 0 0 。c 下酶活性 半衰期约3 0m i n 。最适反应p h 值为5 6 6 0 ，在p h 5 6 4 范围内酶活性保留9 0 以上， 不依赖于c a 2 + 。 将正确构建的重组质粒转化毕赤酵母g s l l 5 细胞，该基因在酵母细胞中也得到了表 达。在酵母a f a c t o r 3 乏a o x l 基因启动子和终止信号的调控下，该a 淀粉酶在毕赤酵母中 大量表达并分泌到胞外。该酶的表达受甲醇的严格调控和诱导，随着诱导培养时问的增 加在培养基上清液中的单位体积酶活力相应上升，在诱导培养五天后酶活力达到最大 值。但该酶的性质发生了变化，最适温度降为7 0 c ，最适反应p h 值为5 6 ，可能是由于 受到糖基化的影响，有待进一步实验证实。 关键词：高温酸性a 淀粉酶；基因合成；表达；酶学性质 a b s t r a c t a a m y l a s ea r eo fc o n s i d e r a b l ec o m m e r c i a lv a l u e i tc a l lb ep r o d u c e db ya w i d ev a r i e t yo f m i c r o o r g a n i s m a b d 5 0 8 8i sat h e r m o s t a b l ea n da c i ds t a b l ea a m y l a s ef r o mt h em u t a t i o no f t h e r m o c o c c u ss p b a s e do nt h ec o d o nb i a so f p i c h i ap a s t o r i s ，t h es e q u e n c eo fb d 5 0 8 8g e n e w a so p t i m i z e di no r d e rt h a ti tc o u l de x p r e s sh i g he f f i c i e n t l yi nt h el ： i c h i ap a s t o r i s b d 5 0 8 8 w a s s y n t h e s i z e db yt w o s t e ps y n t h e s i sm e t h o d t h eg e n ei s1 3 1 1b pl o n ga n d e n c o d e sa p r o t e i no f4 3 7a m i n oa c i d s t h e nb d 5 0 8 8g e n ew a s c l o n e di n t oe x p r e s s i o nv e c t o rp e t 3 0 a c o n s t i t u t i n gr e c o m b i n a t i o nv e c t o rp e t b d 5 0 8 8w h i c h w a st r a n s f o r m e di n t ob l 2 1 ( d e 3 ) p o s i t i v et r a n s f o r m a n tw a sc u l t i v a t e da n di p t gw a sa d d e di n t oc u l t u r et oi n d u c ee x p r e s s i o no f t h ea a m y l a s e a n a l y z e db ys d s - p a g e ，t h er e c o m b i n a n te n z y m eb d 5 0 8 8h a dam o l e c u l a r m a s so f4 8 k d a t h eo p t i m u mr e a c t i o nt e m p e r a t u r ea n dp hv a l u eo ft h er e c o m b i n a n t - a m y l a s e w e r e8 0 9 ca n d5 6 - 6 0r e s p e c t i v e l y t h ee n z y m a t i ca c t i v i t yf o ri tw i t hah a l fl i f eo fh a l fa n h o u ra t1 0 0 * ca n d9 0 o fi t sm a x i m a l a c t i v i t yw a s r e t a i n e db e t w e e n7 0 c - 8 0 c a f t e r i n c u b a t i o no ft h ee n z y m ea t1 0 0 。cf o r3 0 m i n ，t h er e c o m b i n a n ta a m y l a s er e t a i n e d9 5 h i g h e rr e s i d u a la c t i v i t y t h er e c o m b i n a n ta a m y l a s ew a sr e l a - t i v e l ys t a b l ep hv a l u ew a s i n t h er a n g eo f5 0 _ 6 4 ，w i t h o u ta d d i t i o no fe n d o g e n o u sc a 2 + t h ea c t i v ea a m y l a s eg e n eb d 5 0 8 8w a sc l o n e di n t ot h ee x p r e s s i o nv e c t o rp h b m 9 0 5 b a n dt h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a sn a m e d9 0 5 b b d 5 0 8 8 t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a s l i n e a r i z e da n dt r a n s f o r m e di n t op p a s t o r i sg s l l 5 a c t i v i t yo fa - a m y l a s es e c r e t e df r o mt h e r e c o m b i n a n tg s l l 5 ( 9 0 5 b b d 5 0 8 8 ) r e a c h e dm a x i m a la c t i v i t yo nt h e5 t hd a y t h er e c o m i n a n t g s l1 5w a sf e r m e n t e dw i t hh i g hd e n s i t yl i q u i dm e d i aa n di n d u c e db y1 0 m e t h a n o la t c u l t u r et e m p e r a t u r e2 5 t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ea n dp hv a l u eo fa a m y l a s ew a s7 0 a n d 5 6 ，r e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：t h e r m o a c i d o p h i l ia - a m y l a s e ；g e n es y n t h e s i s ；e x p r e s s i o n ；e n z y m ec h a r a c t e r i z a t i o n i i i a m p k a n g g m l p l b p k b k d d h m m s e c i p m d m s 0 d n t p e d 慢a i p t g s d s l b 缩略词 a m p l i c i l l i n 氨苄青霉素 k a n a m y c i n 卡那霉素 g r a m 克 m i c r o g r a m 微克 m i l l i l i t e r 毫升 m i c r o l i t e r 微升 b a s ep a i r碱基对 k i l o b a s e 千碱基 k i l o d a l t o n 千道尔顿 d a y 天 h o u r 小时 m i n u t e 分钟 s e c o n d 秒 r o t a t i o np e rm i n u t e每分钟转速 d i m e t h y ls u l f o x i d e二甲基亚砜 d e o x y r i n e d i a m i n et r i p h o s h a t e脱氧核糖核苷三磷酸 e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 i s o p r o p y l t h i o b - d g a l a c t o s m e 异丙基b - d 一半乳糖苷 s o d i u md o d e c y l s u l p h a t e十二烷基硫酸钠 l u r i a b e r t a n im e d i u ml b 培养基 v i 湖北大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所 取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表 或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确 方式标明。本声明的法律后果由本人承担。 论文作者签名：免、兰 时间：讪。够年多月j 日 学位论文使用授权说明 本人完全了解湖北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：按照学校要求 提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供 目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 ( 保密论文在解密后遵守此规定) 论文作者签名：兔、兰 签名日期：沙婷舌月，汨 导师签名：马f 四焉， 签名日期：伊产石月，碉 a 伊五 第一部分文献综述 第一部分文献综述 1 1q 一淀粉酶的研究概况 1 1 1 发现和分类： 淀粉酶是较早发现的酶类之一，早在1 8 3 3 年p a y e 柝p e r s o z 己首次从麦芽的水抽提物 中用酒精沉淀分离到淀粉酶【1 1 。1 8 9 4 年高峰让吉从米曲霉( a s p e r g i l l n so r y z a e ) 中提取 出作为消化剂的酶，即高峰淀粉酶。1 9 1 9 年法国b o i d i n 和e f f r o n t 首次用枯草杆菌生产淀 粉酶。 淀粉酶大致可分为四大类。第一类，a 淀粉酶( e c 3 2 1 1 ) 以糖原或淀粉为底物从 分子内部切开a 1 ，4 糖苷键而使底物水解，其终产物为葡萄糖、还原糖、极限糊精和含四 个以上葡萄糖残基的低聚糖。第二类b 淀粉酶( e c 3 2 1 2 ) 从底物非还原性末端顺次 水解每隔一个a 1 ，4 糖苷键，切下的是麦芽糖单位。第三类葡萄糖淀粉酶( e c 3 2 1 3 ) ， 习惯上简称糖化酶，从底物的非还原性末端顺次水解a 1 ，4 糖苷键和分支的a 1 ，6 键生成葡 萄糖。第四类解枝酶或异淀粉酶( e c 3 2 1 9 ) 只水解糖原或支链淀粉分支点a 1 ，6 糖苷键， 切下整个侧枝。 按照使用条件a 淀粉酶可以分为中温型，高温型，耐酸耐碱型。按产生菌不同又可 分为细菌、真菌、植物和动物淀粉酶。 随着研究的深入和生产实践的需要，人们开始开发新的酶品种，1 9 5 5 年c a m p b e l l 首 先从嗜热菌凝结芽抱杆菌( b a c i l l u sc o a g u h n s ) 纯化到耐高n a 淀粉酶【2 】，1 9 7 3 年m a d s o n 等人首次从地衣芽孢杆菌( b a c i l l u sl i c h e n f o r m i s ) 提取到热稳定的a 淀粉酶，接着就将 高温a 淀粉酶投入了生产应用【3 1 。 1 1 2a 一淀粉酶的作用机理 a 淀粉酶为1 ，4 a d 葡萄糖苷水解酶，作用淀粉时可从分子内部切开a 1 4 键生成小 分子糊精和还原糖，产物末端葡萄糖残基c 碳原子为a 构型，故称a 淀粉酶，a 淀粉酶不 能切开支链淀粉分支点的a 1 ，6 键，也不能切开a 1 ，6 键附近的a 1 ，4 键，水解产物中除了 葡萄糖和还原糖外，残留a 1 ，6 键极限糊精和含四个以上葡萄糖残基的低聚糖，所以底物 分子越多，水解度越低。 1 1 3 产生a 一淀粉酶的微生物主要种类及其性质 a 一淀粉酶在动物、植物、微生物中均能产生，但大量生产主要还是靠微生物发酵。 微生物中许多种类均能产生a ，淀粉酶。其中有关的属有：b a c i l l u s ，b a c t e r o i d e s ， 湖北大学硕士学位论文 c l o s t r i d i u m ，t h e r m o m o n o s p o r a ，a c i n e t o b a c t e r ，t h e r m o p h i l e ，p s e u d o m o n a s ，s t r e p t o m y c e s ， m o a c t i n o m y c e s ，a s p e r g i l l u s ，m u c o r ，n e u r o s p o r a ，p e n i c i l l u s 等。b u c h a n a n 等描述- j b a c i l l u s 属4 8 个种有3 2 个己报道能产生a 淀粉酶。世界许多国家都以枯草杆菌( b ) 生产的细菌 淀粉酶和米曲霉( a ) 生产的真菌淀粉酶为主要产品。近年来不少科学家己转向耐热a 淀粉酶和碱性a 淀粉酶的研究。 1 1 4q 一淀粉酶基因的结构特点 随着分子生物学的发展，人们在研究清楚a 淀粉酶的蛋白质氨基酸结构以后，已经 分别从假单孢菌 ( p s e u d o m o n a ss t u t z e r im o 1 9 ) 米曲霉( a s p e r g i l l u so r y z a e ) 枯草杆菌 ( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 黄单胞菌( x a n t h o m o n a sc a m p e s t u i sp v ，c a m p e s t r i s ) 等以及动物和植 物中克隆到了a 淀粉酶基因，t o n o z a k a ( 1 9 9 3 ) 通过对不同来源的3 7 个a 淀粉酶基因， 分支酶基因，异淀粉酶基因等进行同源序列的比较，微生物与动物和植物产生的a 淀粉 酶的氨基酸序列之间的同源性不超过1 0 ，但发现这些淀粉酶有a b c d 四个区域有高度 的保守性，推测这些保守区域与其底物的结合或催化中心有关。通过对a 淀粉酶基因结 构的分析，发现在结构基因之前，有由不同的氨基酸组成的信号肽，在g + 细菌如枯草芽 孢杆菌等中分泌到胞外。a 淀粉酶的全部或部分氨基酸序列，由具体对应核苷酸序列推 算得出或直接通过氨基酸测定得出。a 淀粉酶是由多种氨基酸组成，其中含硫氨基酸的 量特别低，而含二疏基氨基酸的量相当高，这可能与a 淀粉酶的稳定性和催化活性有关。 如枯草杆菌a 淀粉酶含a s p 署1 g l u 的量很高，米曲霉含a s p $ 1 t y r 的量较高，两者都含有极 低量的m e t 和h i s ，不同来源的a 淀粉酶，其氨基酸组成存在差异。 尽管不同来源的a 一淀粉酶在氨基酸序列上是不同的，但它们却共同拥有相同的基本 次级结构”】，如( a 8 ) 结构由8 个a 螺旋包围8 个b 折叠组成的筒状结构。最近更多的 研究表明，除了a 淀粉酶之间的相似性，许多淀粉酶和寡聚糖降解酶在结构上可能也是 相关的，它们也许拥有相同的活性中心结构特征。m a c g r e g o r 与s v e n s s o n 根据序列相似性 利用组合算法对二级结构预测，认为在a o r y z a ea 淀粉酶、酵母a 葡萄糖酶、环状糊精 葡聚糖酶三者的催化区的三维结构之间具有很大程度的同源性【6 1 。随着分子生物学的发 展，a 淀粉酶基因结构与关系将会研究的越来越清楚，将为进一步提高a 淀粉酶活性提 供理论基础，为a 一淀粉酶的应用提供更广阔的前景。 1 1 5q 一淀粉酶的一般性质 a 淀粉酶一般在p h 5 5 8 时稳定，p h 4 以t 容易失活，酶的最适p h 值为5 6 。但是， 2 第一部分文献综述 不同来源的a 淀粉酶有不同的p h 特性，例如，哺乳动物a 淀粉酶在氯离子存在的条件下， 其最适p h 值为7 0 。黑曲酶a 淀粉酶的耐酸性强，其最适p h 值为4 o ，在p h 2 5 条件下， 4 0 c 处理3 0 分钟，酶的活性不受影响，而在p h 7 0 时，5 5 处理1 5 分钟，酶活性几乎完 全丧失。米曲霉a 淀粉酶则耐酸性弱，在p h 7 0 时，5 5 处理1 5 分钟，酶活性几乎不受 影响，而在p h 2 5 时处理，则完全失活。枯草杆菌a 淀粉酶的最适p h 值范围为5 7 ，嗜碱芽 孢杆菌a 淀粉酶的最适p h 范围为9 2 1 0 5 。 纯化的a 淀粉酶在5 0 以上容易失活，最适温度为7 0 ，在存在钙离子或在高浓度 的淀粉液中，酶对热的稳定性增加。芽孢杆菌产生的a 淀粉酶耐热性较强，枯草芽孢杆 菌a 淀粉酶在6 5 以下稳定，最适温度为7 0 * ( 2 ，在高浓度的淀粉浆中，最适温度达到 8 5 9 0 。c 。嗜热芽孢杆菌的a 淀粉酶的热稳定性更高，一般最适温度高达9 0 9 5 ，有的 在1 1 0 1 1 5 。c 的高温条件下，仍然可以催化淀粉水解。地农芽抱杆菌a 淀粉酶与其他大多 数a 淀粉酶不同，其热稳定性不依赖于钙离子，在e d t a 存在下，对酶的活性无明显影 响。 a 淀粉酶是一种金属酶，每个酶分子中含有至少一个钙离子( c a 2 + ) 。钙离子可使 酶分子保持适宜的空间构象，从而维持酶的活性并提高其稳定性【7 1 。钙离子与酶分子结 合的牢固程度，依据酶的来源不同而有所差别，其顺序为霉菌 细菌 动物 植物。嗜热 脂肪芽孢杆菌与枯草杆菌a 淀粉酶在热稳定性上之所以不同，是由于高温对钙离子的亲 合力不同【7 l 。 钠离子、镁离子、钡离子、氯离子等都有助于提高a 淀粉酶的稳定性。此外，乙二 醇、甘油、山梨醇、谷氨酸等也是a 淀粉酶的良好稳定剂【8 1 ，而最常用的还是钙离子。 a 淀粉酶的相对分子量范围为1 5 ，6 0 0 13 9 ，3 0 0 ，通常；呋j 4 5 ，0 0 0 6 0 ，o o 旅t 9 1 。在有锌 离子存在的条件下，两个酶分子可结合成为二聚体，其相对分子质量约为1 0 0 ，0 0 0 左右， e d t a 可使二聚体解离为单体【1 0 】。 1 1 6a 一淀粉酶的主要用途 a 淀粉酶在工农业生产中有许多用途。应用范围涉及到工、农、医各个领域。在淀 粉加工方面利用a 淀粉酶制造葡萄糖，果葡糖浆、怡糖、改性淀粉、糊精、浆糊、粘着 剂等。在发酵工业方面，利用a 淀粉酶对发酵工业的主要原料淀粉进行液化( 酒精发酵、 啤酒发酵、抗生素发酵、味精发酵以及酶制剂等生产的原料液化) 。在纺织品工业中， 利用a 淀粉酶对各类织物褪浆。在食品工业中，利用a 淀粉酶制作面包及其它食品的前 处理。在医药上可作为消化剂。在饲料加工业中也有它的身影，另外在果汁制造、蔬菜 3 湖北大学硕士学位论文 加工、清洗剂、香料加工等方面也有广泛的用途，可以说a 淀粉酶的应用己深入到各行 各业，现就有关a 淀粉酶的主要用途列于表1 1 。 表1 - 1a 淀粉酶的主要用途 题途迸堕 淀粉加工制造葡萄糖浆 酿造发酵业 纺织品工业 面包工业 医药工业 饲料工业 其他 制造饴糖 制造葡萄糖 制造各种粉末糊精 制造各种浆糊、粘着剂 啤酒原料的液化 酒精原料的液化和糖化 各种织物退浆 改善质里风味，缩短时间，节约用糖 消化药 与其他酶一起添加促进消化 香料加工、造纸、石油压裂、果汁制造 不同性质的a 淀粉酶具有不同的用途。耐热性a 淀粉酶，由于使用时温度提高，液 化完全，用酶量少，操作比较容易，自1 9 7 3 年问世以来，使双酶糖化产葡萄糖真正在工 业上得到应用。耐热性a 淀粉酶也适用于棉布退浆及石油压裂液处理等。米曲霉a 淀粉 酶耐热性差，应用面包工业，可避免应用高温a 淀粉酶而使面包过度液化，口感变差的 现象。黑曲霉酸性a 淀粉酶适用于消化药物制造，糖化性细菌淀粉酶具有较多的麦芽糖， 可以制造低d e 值糖浆。 1 1 7 耐高温q 一淀粉酶的研究进展 耐高温a 淀粉酶通常是指最适反应温度为9 0 9 5 、热稳定性9 0 以上的a 淀粉 酶，比从淀粉芽孢杆菌生产的中等耐热性a 淀粉酶高1 0 2 0 ，与一般细菌a 淀粉酶相 比，用耐高温一淀粉酶液化淀粉具有以下优点：在9 0 。c 以上高温液化淀粉反应快，液 化彻底，可避免淀粉分子胶束重排形成难溶性的团粒，因此过滤容易，可节省能源。 对c a 2 - 依赖性小，液化时不需添加c a 2 ，故糖化液的精制大为省力，成本可以下降。 酶的稳定性好【1 2 l ，因此广泛应用于酿酒、食品、医药、纺织和环境治理等行业的重要酶 4 第一部分文献综述 类，由于它的重要商业价值，致使人们积极寻找产生该酶的新菌株，或者用生物工程的 方法寻找该酶的基因，改造菌株。 微生物中许多种类都能产生淀粉酶，b u c h a n a n 和t a m u r i 【2 0 】【2 1 】等人描述了数百种嗜热 真菌和上千种细菌，仅b a c i l l u s 属4 8 个种中就有3 2 个种能产生a 淀粉酶，但产生耐高温a 淀粉酶的菌种较少。c a m p b e l l 等首先从凝结芽孢杆茵( b a c i l l u sc o a g u l a n s ) 纯化出耐高 温a 淀粉酶，接着又从枯草芽孢杆菌( b s u b t i l i s ) 、嗜热芽孢杆菌( b s t e a r o t h e r m o p h i l u s ) 、 地衣芽孢杆菌( b 1 i c h e n i f o r m i s ) 等菌株中分离出该酶。 早在1 9 1 5 年法国b o i d e n 等开始由枯草杆菌生产细菌淀粉酶，并在工业上用于纺织品 退浆。从5 0 年传开始，人们着手研究耐高温a 淀粉酶，并有过不少报道，他们都采用高 温菌为材料，由于培养基成份价格昂贵，培养条件严格，产酶量少等原因，均未能实现 生产。自1 9 7 3 年m a d s e n 掣”】报道了采用常温地衣芽孢杆菌得到了一种新的耐高温a 淀粉 酶，在高温1 1 0 下能液化淀粉。开始突破了耐高温a 淀粉酶的工作，并投入工业应用。 1 9 8 0 年m e d d a 1 9 】等报告了二株新菌株地衣芽孢杆菌( b 1 i c h e n i f o r m i s ) ，凝结芽孢杆菌 ( b c o a g u l a n s ) 在碱性p h 条件下产生耐热a 淀粉酶，在9 1 。c 能维持稳定l d , 时，最适p h 为9 5 1 9 8 4 年，g r u e n i n g e r 从污泥中分离到一株产耐热a 淀粉酶的嗜热脂肪芽孢杆菌 ( b s t e a r o t h e r m o p h i l u s ) 的亚种，在3 或4 种复合成份的培养基中( 像蛋白陈、大豆粉和 麦芽提取物等) 产生较高的酶活力。该酶最适温度是8 0 ，在9 5 2 小时酶活性失活5 0 ， 然而在有底物淀粉存在时，活性能保持3 d , 时以上。淀粉分解产物主要是麦芽三糖、麦 芽糖和少量葡萄糖。1 9 8 1 年t a m u r i1 1 4 】用嗜热脂肪芽孢杆菌得到的耐高温a 淀粉酶无c a 依赖性，在无c a 2 ，9 0 。c ，p h 6 0 处理1 0 分钟，酶活残留7 0 。1 9 8 5 年丸尾【1 1 】报道以地衣芽 孢杆菌n y k 2 4 为出发菌株，对各种诱变方法作了比较，发现n t g 的诱变效果最好，通过 六次连续诱变与自然选择，酶活增加了二千倍，挑选环丝氨酸抗性突变株，随着抗药性 增加，酶活力增。但因出发菌株酶活力极微，故无实用价值。另外以嗜热脂肪芽孢杆菌 作为研究对象的较多，这一期间k i n d l e1 1 5 1 等的低c a 2 + 要求的耐高温a 淀粉酶，n a 砌o r i 【1 6 】 等的耐高温淀粉酶均是来自嗜热脂肪芽孢杆菌，m i e l e n z 1 7 】等将耐高温a 淀粉酶克隆到大 肠杆菌、枯草芽孢杆菌中，所采用的源基因也是来自嗜热脂肪芽孢杆菌。1 9 9 7 年，u g u r u 1 8 j 等从磨粉厂废料土壤中分离得到t t h e r m a c t i n o m y c e st h a l p o p h i l u s ，可用玉米浆作为碳 源，1 0 0 ，p h 5 0 下耐高温a 淀粉酶的半衰期为3 0 m i n 。 1 9 8 7 年任天明【2 2 】等完成了嗜热脂肪芽孢杆菌的耐高温a 淀粉酶基因在大肠杆菌中 5 湖北大学硕士学位论文 的克隆和表达。1 9 8 9 年胡学智【矧从地衣芽孢杆菌中选育得到无孢子突变株a 4 0 4 1 ，酶活 力达n 2 0 u m l ，最适反映温度达n 9 0 9 5 ，9 0 c 下处理l h 不失活。其后，凌晨【驯等用 a 4 0 4 1 e 出发，用原生质体融合技术进行了菌种改良的研究，结果显示菌种改良后酶活 稳定提高了1 5 倍。1 9 9 0 年金风燮瞵】从曲中分离得到生产耐高温a 淀粉酶的菌种，经鉴定 是b a c i l l u s 属中的新种，所产耐高温a 淀粉酶酶活力达至l j l 0 0 0 u m l ，在8 0 8 5 c 下能保持 3 h 不失活，1 0 0 。c 、1 0 m i n 后有1 5 的残留酶活力。1 9 9 f f l 显良f 2 6 j 等利用地衣芽孢杆菌突 变株产耐高温a 淀粉酶，所得酶液在不) j i c a 2 十和无任何保护剂条件下于9 0 。c 处理6 0 m i l l ， 9 5 c 处理2 0 m i n 后，酶活力均能保留9 0 以上。1 9 9 7 年李瑶【2 7 】等在金凤燮的基础上进行 诱变，使酶活力提高至l j 2 9 4 0 u m l 。1 9 9 8 年王磊【2 8 】等在枯草杆菌中扩增表达耐高温a 淀粉 酶基因，在无任何选择压力的情况下，使酶活力达n 2 2 0 u m l 。2 0 0 2 年卢涛【2 9 】等在土壤 中筛选到一株凝结芽孢杆菌，经诱变处理，酶活力达n 1 0 0 u l m l 。 1 2 基因合成 1 2 1 基因全合成的历史与现状 对于基因全合成方法的探索很早便已经开始，大致可以追溯到上个世纪6 0 年代1 3 0 】。 早期的基因全合成主要是用核酸连接酶连接寡聚核苷酸片段以得到完整的基因【3 ”们，这 就对寡聚核苷酸片段提出了很高的要求，它们需要被磷酸化并且用p a g e 方法纯化 【3 3 】f 3 4 1 。对寡聚核苷酸片段的这些处理使得早期的合成方法非常的繁琐和昂贵。 改进了的基因全合成方法仍然以寡聚核苷酸片段为原材料，只是由于p c r 技术的 出现，寡聚核苷酸片段改由p c r 方法拼凑成全长基因。例如，发展于1 9 世纪早期的自 身引物p c r 3 7 - 4 0 l ，出现于1 9 9 5 年并在2 0 0 2 年得到进一步改进的p c r 组装方法【4 1 】【4 2 1 。 基因全合成方法的改进实质是寡聚核苷酸片段的设计和组装方式的改进。比如，在连续 p c r 方法中，寡聚核苷酸片段被设计成由两端向中间连续合成，而在s t e m m e re ta l 描 述的重叠扩增p c r 方法中，彼此靠近的两个寡聚核苷酸片段的延伸方向是相反的，它 们彼此重叠，中间没有间隔，覆盖了全长基因的两条链。 高的合成费用和错误率是目前所有基因合成方法所共同面临的共同问题，所以也是 生物学家们所致力解决的问题。l e iy o u n g 和o i h a nd o n g 于2 0 0 4 年4 月在( ( n u c l e i ca c i d s r e s e a r c h ) ) 上报道了一种两步法基因全序列合成方、法【4 引，它是对s t e m m e re ta l 重叠扩增 方法的一种改进，整个合成分为两步，首先把相邻的四个寡聚核苷酸片段混合进行p c r 反应，然后把第一步合成的所有小片段混合扩增出全长片段。通过这种方法他们正确的 6 第一部分文献综述 合成了从4 7 0 b p 到1 2 k b 长度的几个基因片段。为了降低成本，他们尝试在寡聚核苷酸 片段间减少重叠，增加间隔，但这种方案因会导致碱基缺失或突变而被否决。 a i - s h e n gx i o n g ，q u a n h o n gy a o 等2 0 0 4 年7 月同样是在( n u c l e i ca c i d sr e s e a r c h ) ) 上发表了一篇名为as i m p l e ，r a p i d ，h i g h - f i d e l i t ya n dc o s t e f f e c t i v ep c r b a s e dt w o - s t e p d n a s y n t h e s i sm e t h o df o rl o n gg c n es e q u e n c e s ”的文章m 1 ，利用这种方法，他们成功的得 到了1 0 k b 到5 4 k b 的几个基因。与上种方法不同的是，因为合成的基因较长，他们所 用的寡聚核苷酸片段更长( 6 0 b p ) ，中间有4 0 b p 的间隔，而且在第一步中他们不是将4 个而是将1 2 个相邻的寡聚核苷酸片段混合进行p c r 扩增。为了提高忠实性，他们使用 的是高保真的d n a 聚合酶p f u 和p y r o b e s t ，但是在他们合成的基因中，平均有o 3 的 错误率。 m u t s 蛋白有一种特殊的结合错配d n a 的能力，因而被用于解决基因全合成中出现 的令人头痛的突变问题。i n d r a n i lb i s w a s 和p e g g yh s i e h 在1 9 9 9 年对m u t s 蛋白的功能作 了详细的论证【4 5 1 ，并且预言，m u t s 蛋白将在未来的生物化学和结构研究中的错配结合 和突变检测应用方面发挥重要作用。果然如他们所料，在2 0 0 4 年1 1 月的( ( n u c l e i ca c i d s r e s e a r c h ) ) 上【4 6 1 ，p e t e r ac a r t 等通过实验验证得出结论，将m u t s 蛋白用于基因合成中， 可以在常规合成方法的基础上把错误率降低1 5 倍，最终错误率约为1 1 0 0 0 0 。在2 0 0 5 年3 月的( ( n u c l e i ca c i d sr e s e a r c h ) ) 上，b r o c ke b i n k o w s k i 等将m u t s 蛋白用于合成g f p 基因【4 7 1 ，结果把错误率从1 k b 3 k b 降到1 3 5 k b 。 总之，通过众多科学家的努力探索，基因全合成的方法不断趋于完善。然而昂贵的 合成费用和高的突变率阻碍了基因全合成技术像寡聚核苷酸片段的合成，p c r 反应和 d n a 测序那样成为一种普遍使用手段。所以我们目前的目标仍然是继续改进基因全合 成方法以进步降低合成费用和错误率。 1 2 2 基因全合成的目的与意义 基因的合成和表达是分子生物学中的重要技术。化学合成d n a 序列为修改基因， 阐述基因功能，研究蛋白质结构和功能的关系提供了一个强有力的手段。化学合成d n a 分子方法的发展使得合成和组装基因以改善或更新其功能成为可能。在很多情况下，我 们必须用化学合成的方法改变密码子序列以提高基因表达水平及其表达产物的稳定性。 在后基因组时代，能够合成任意d n a 片段的技术显得尤为重要。 传统的基因合成方法主要有化学合成法和p c r 方法。然而，化学合成法比较适合 合成小片段基因，而用来合成较大片段的基因是非常昂贵的，并且出错的机率也很高。 7 湖北大学硕士学位论文 p c r 的克隆技术需要d n a 作为模板，但模板有时是无法得到的。特别是在酶工程的应 用中，需要的d n a 序列一般是不存在的。并且，天然的d n a 序列可能在不同的生物 中也不能很好的表达，因此需要优化密码子以达到有效的表达。位点定向突变可以用来 解决一些问题，但如果太多的碱基需要改变，它将变得非常的繁琐和昂贵。 所以在很多时候，当我们知道某一功能基因的序列，但无法得到基因，或者此功能 基因无法在用于表达的生物中有效的表达，需要优化密码子，那么就不得不用人工的方 法合成目的基因的全序列。 目前有许多基因和蛋白质的核苷酸和氨基酸序列已得到阐明，人们已经可以根据需 要合成出具有实际应用和研究价值的多肽和蛋白质基因。己报道的合成基因有人生长激 素、干扰素、胰岛素、表皮生长因子、白细胞介素i i 、集落刺激因子等，绝大多数已在 原核和真核系统中获得表达。 1 2 3 目前基因合成方法的优缺点 对于早期的酶连法合成基因，由于其对寡聚核苷酸片段要求过高( 寡聚核苷酸片段 需要被磷酸化并且用p a g e 方法纯化) ，已经被研究者所舍弃。s t e m m e re ta l 描述的p c r 组装法的优点是相对较低的费用，因为它不需要对引物进行磷酸化和凝胶纯化。但是这 种方法不能稳定的用于所有的基因，并且对于每一个基因需要单独进行优化。l e iy o u n g 和q i h a nd o n g 的两步法合成全基因，是对s t e m m e re ta l 重叠扩增方法的一种改进，不 但不需要对引物进行磷酸化和凝胶纯化，并且消除了引物序列和反应条件优化的需要。 虽然用这种方法成功的合成了从4 7 0 b p 到1 2 k b 的几个基因，但因为所使用的寡聚核苷 酸片段很短并且之间没有间隔，必须覆盖基因的两条链的长度，所以如果用它来合成较 长片段的基因也会非常的繁琐和昂贵。a i s h e n gx i o n g ，q u a n h o n g y a o 等的针对长基因 序列的两步合成法正好可以解决这个问题，然而，他们又出现了新的麻烦，在他们的合 成结果中，平均有o 3 的错误率。为解决突变问题，m u t s 蛋白被用于基因全合成方法 之中。 1 3 基因表达技术的研究概况 1 3 1 基因表达的基本概念及特点 1 3 1 1 基因表达的概念 基因表达( g e n ee x p r e s s i o n ) 是指生物体内基因组中特定的结构基因在特定的条件 下通过转录、翻译等一系列的复杂过程，合成具有特定氨基酸序列并具有特定生物学功 8 第一部分文献综述 能的蛋白质分子。r 砌怕威t r n a 的基因经转录和转录后加工产生成熟的r r n a 或t r n a ， 也是r r n a 或t r n a 的基因表达，因为r l 玳a 或t r n a 就具有在蛋白质翻译方面的功能。基 因表达调控的研究己成为当代分子生物学的一个研究热点。每一个特定的结构基因的表 达都是在生物体发育的特定阶段，在特定的组织中或细胞中才得以进行，即生物体内基 因的表达具有选择性和程序性，而且表达的数量也是特定的。对基因表达调控的研究的 深入对于构建合适的表达系统来高效表达目的基因的研究有着极大的推进作用。 1 3 1 2 基因表达的特点 生物个体的各种组织细胞一般都有相同的染色体数目，每个细胞含的d n a 量基本相 近。这些体细胞也像生殖细胞一样含有个体发育、生存和繁殖的全部遗传信息。但这些 遗传信息的表达是受到严格调控的，通常各组织细胞只合成其自身结构和功能所需要的 蛋白质。不同组织细胞中不仅表达的基因数量不相同，而且基因表达的强度和种类也各 不相同，这就是基因表达的组织特异性。细胞特定的基因表达状态，就决定了这个组织 细胞特有的形态和功能。如果基因表达调控发生变化，细胞的形态与功能也会随之改变， 例如正常组织细胞转化为癌瘤细胞的过程，就首先有基因表达方面的改变：人肝细胞在胚 胎时期合成甲胎蛋白( a f p ) ，成年后就很少合成a f p 了，但当肝细胞转化成肝癌细胞 时编码a f p 的基因又会开放，合成a f p 的量会大幅度提高，成为肝癌早期诊断的一个重 要指标。细胞分化发育的不同时期，基因表达的情况是不相同的，这就是基因表达的阶 段特异性。一个受精卵含有发育成一个成熟个体的全部遗传信息，在个体发育分化的各 个阶段，各种基因极为有序地表达，一般在胚胎时期基因开放的数量最多，随着分化发 展，细胞中某些基因关闭、某些基因转向开放，胚胎发育不同阶段、不同部位的细胞中 开放的基因及其开放的程度不一样，合成蛋白质的种类和数量都不相同，显示出基因表 达调控在空间和时间上极高的有序性，从而逐步生成形态与功能各不相同、极为协调、 巧妙有序的组织脏器。即使是同一个细胞，处在不同的细胞周期状态，其基因的表达和 蛋白质合成的情况也不尽相同，这种细胞生长过程中基因表达调控的变化，正是细胞生 长繁殖的基础【4 引。 1 3 2 基因表达技术的方法 1 3 2 1 原核生物基因表达系统 利用原核细胞表达外源基因是基因工程中最常用的方法，现己发展较为成熟的原核 表达系统有：大肠杆菌表达系统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统等。本研究采用 的是大肠杆菌表达系统。 9 湖北大学硕士学位论文 人类对大肠杆菌经过长期的研究，对其特性和遗传背景了解得最清楚，大肠杆菌培 养操作简单、生长繁殖快、价格低廉，人们用大肠杆菌用于外源基因的表达已有很多年 的经验积累。s t r u h l 等( 1 9 7 6 ) 4 9 】，v a p n e k 等( 1 9 7 7 ) 5 0 和l h a n g 等( 1 9 7 8 ) 1 5 1 】分别将酿酒 酵母d n a 片断，粗糙链孢霉d n a 片断和哺乳动物c d n a 片断导入大肠杆菌，引起其表型 的改变，证明了外源基因在大肠杆菌中可以实现有功能的活性表达。1 9 8 0 年g u a r a n t e 等 发表了以质粒、乳糖操纵子为基础建立起来的大肠杆菌表达系统，这一发明构成了大肠 杆菌表达系统的