（微生物学专业论文）致病杆菌属三潜在新种的鉴定与描述.pdf

题目 致病杆菌属三潜在新种的鉴定与描述 专业 微生物学 硕士生 王闻 指导教师 邱礼鸿副教授 摘要 昆虫病原线虫共生菌目前已定名的有两个属 致病杆菌属 x e n o r h a b d u s 和发光杆菌属 p h o t o r h a b d u s 这类细菌存在于其宿主线虫的肠道内 两者形 成典型的共生关系 昆虫病原线虫及其共生菌复合体已成为一类新型生物杀虫 剂 在害虫生物防治中发挥着重要作用 共生菌产生的多种具有生物活性的代谢 产物 如杀虫毒素 抗生素等已引起人们的关注 成为另一研究热点 共生菌的 采集 鉴定和分类是开发利用这类重要生物资源的基础 本研究对我室采集到的三个昆虫病原线虫新种 s t e i n e r n e m aa c i a r ig d h 7 l e i z h o u e n s eg d e 3 2 8 和 e m e r n e m as p y n d 7 2 所携带的三株共生菌g d h 7 g d e 3 2 8 和y n d 7 2 进行了鉴定和描述 首先采用p c r 克隆和测序手段获得这 三株菌的1 6 sr d n a 和母相基因的近乎全长序列 基于1 6 sr d n a 全长序列构建 的系统发育树显示g d h 7 g d c 3 2 8 和y n d 7 2 属于致病杆菌属 它们之间的序列 相似性低于9 8 7 与该属已定名种的相似性低于9 7 9 基于g y r b 基因序列分 析得到的g d h 7 g d e 3 2 8 和y n d 7 2 的分类地位与上述基于1 6 sr d n a 序列分析 所得结果基本一致 对这三株共生菌的形态与生理生化特性的分析结果显示 该 三株菌的大部分生理生化特性与致病杆菌属相符 而这三株菌之间以及它们与该 属各已定名种之间在生理生化特征上存在一些明显差异 采用基因组d n a d n a 杂交的方法对这三株菌以及与其亲缘关系较近的两个定名种进行同源性分 析 结果显示所测五株菌之间的同源性均低于6 0 综合上述研究结果可以初步 判定g d h 7 g d c 3 2 8 和y n d 7 2 为致病杆菌属的三个新种 当然 只有正式发表 后才能成为有效新种 关键词 昆虫病原线虫共生菌 1 6 sr d n a 表型鉴定 d n a d n a 杂交 t i t l e i d e n t i f i c a t i o na n d d e s c r i p t i o no f t h r e ep o t e n t i a ln e ws p e c i e so f x e n o r h a b d u s m a j o r m i c r o b i o l o g y n a m e w a n gw e n s u p e r v i s o r q i ul i h o n ga s s o c i a t ep r o f e s s o r a b s t r a c t s p e c i e s o fx e n o r h a b d u sa n dp h o t o r h a b d u sa r e s y m b i o t i cb a c t e r i ao f e n t o m o p a t h o g e n i cn e m a t o d e so fs t e i n e r n e m aa n dh e t e r o r h a b d i t i s r e s p e c t i v e l y t h e n e m a t o d e b a c t e r i ac o m p l e x e sh a v eb e c o m ei m p o r t a n tb i o l o g i c a lc o n t r o la g e n t s i th a s a l s ob e e nd e m o n s t r a t e dt h a tt h e s eb a c t e r i ap r o d u c e dm a n ys e c o n d a r ym e t a b o l i t e sw i t h v a r i o u sb i o l o g i c a la c t i v i t i e s s u c ha si n s e c t i c i d a lt o x i n s a n t i b i o t i c sa n da n t i f e e d a n t s c o l l e c t i o na n dc o r r e c tc l a s s i f i c a t i o ni st h eb a s i sf o rf u r t h e rs t u d ya n du t i l i z a t i o no f t h e s eb e n e f i c i a lb a c t e r i a i nt h i ss t u d y t h et a x o n o m i cs t a t u so ft h eb a c t e r i ag d h 7 g d e 3 2 8a n dy n d 7 2 w h i c hw e r ei s o l a t e df r o me n t o m o p a t h o g e n i cn e m a t o d e s a c i a r ig d h 7 s l e i z h o u e n s eg d c 3 2 8a n ds t e i n e r n e m as p y n d 7 2 r e s p e c t i v e l y w a se x a m i n e d t h e a p p r o a c ho fp c r a m p l i f i c a t i o na n ds e q u e n c i n gw a su s e dt oo b t a i nt h en e a r l y c o m p l e t e ds e q u e n c e so f16 sr d n aa n dg y r bg e n eo ft h eb a c t e r i ae x a m i n e d 1 1 1 e p h y b g e n e t i ct r e eb a s e do nt h e16 sr d n as e q u e n c e ss h o w e dt h a tg d h 7 g d c 3 2 8a n d y n d 7 2b e l o n gt ox e n o r h a b d u s a n dt h es e q u e n c es i m i l a r i t i e sw e r el o w e rt h a n9 8 7 a m o n gt h e ma n dl o w e rt h a n9 7 9 b e t w e e na n yo n go f t h e ma n da n yd e s c r i b e d s p e c i e so f x e n o r h a b d u s t h et a x o n o m i cs t a t u so ft h e s et h r e eb a c t e r i ar e v e a l e db yt h e p h y l o g e n e t i ca n a l y s i sb a s e do ng y r bg e n es h o w e ds i m i l a rr e s u l t st ot h a to f16 sr d n a p h e n o t y p i cc h a r a c t e r i z a t i o nr e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eg e n e r a lc h a r a c t e r so f t h e s et h r e e b a c t e r i aw e r ec o n s i s t e n tw i t ht h o s eo fx e n o r h a b d u sw h i l es u b s t a n t i a ld i f f e r e n c e s c o u l dh ef o u n db e t w e e na n yo n eo ft h eb a c t e r i ae x a m i n e da n da n yd e s c r i b e d x e n o r h a b d u ss p e c k s d n a d n ah y b r i d i z a t i o nf o u n dt h a tt h eg e n o m i cd n a h y b r i d i z a t i o nr a t e sb e t w e e ng d h 7 g d c 3 2 8 y n d 7 2a n dt w od e s c r i b e ds p e c i e so f x e n o r h a b d u st h a ta r ec l o s et ot h eb a c t e r i ae x a m i n e dw e r el o w e rt h a n6 0 t 1 1 e n c o m b i n a t i o no ft h ea b o v er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tg d h 7 g d c 3 2 8a n dy n d 7 2a r e l i k e l yt ob et h r e en e ws p e c i e so f x e n o r h a b d u s k e yw o r d s s y m b i o t i c b a c t e r i ao fe n t o m o p a t h o g e n i c n e m a t o d e s 16 sr d n a p h e n o t y p i ci d e n t i f i c a t i o n d n a d n ah y b r i d i z a t i o n 学位论文原创性声明 本人郑重声明 所呈交的学位论文 是本人在导师的指 导下 独立进行研究工作所取得的成果 除文中已经注明引 用的内容外 本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或 撰写过的作品成果 对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体 均已在文中以明确方式标明 本人完全意识到本声明的 法律结果由本人承担 学位论文作者签名 王i 司 日期 砂7 年莎月矽日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留 使用学位论文的规 定 即 学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定 机构送交论文的电子版和纸质版 有权将学位论文用于非赢 利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆 院系资料室 被查阅 有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索 可以采用复印 缩印或其他方法保存学位论文 学位论文作者签名 王j 剿 导师签名 邱x 够 日期 刃9 年舌月莎日 王闻中山大学硕士论文 2 0 0 9 i 厶 j l 月i j吾 昆虫病原线虫与其它昆虫寄生线虫的主要区别在于其体内携带特异的细菌 线虫与其所携带的细菌形成典型的共生关系 线虫依靠细菌产生的多种有生物活 性代谢产物 如杀虫毒素 胞外酶 抗生素和取食驱避剂等 致死昆虫 将虫尸 转化为其能利用的养分和保护虫尸免受环境中其它有机体的侵害 从而保证e n 的顺利生长和繁衍 而细菌则依靠线虫将其带入昆虫体内并保护其免受对其有害 的环境因素的影响 昆虫病原线虫现已成为一类新型生物杀虫剂 已商品化并成功用于防治多种 害虫 除了作为生物杀虫剂外 近年来在e n 共生菌有生物活性代谢产物 如抗 生素 杀虫蛋白毒素等的基础和开发研究方面取得的突破性进展也引起了广泛地 重视 成了另一研究热点 在杀虫毒素方面 自从1 9 9 8 年b o w e n 等在s c i e n c e 上报道了从e n 共生菌中发现的一个有强口服杀虫活性的蛋白毒素以来 现已从 e n 共生菌中发现了多个类型的蛋白毒素 不同类型的蛋白毒素的杀虫谱不同 杀虫机理也不同 2 0 0 3 年完成的共生菌pl u m i n e s c e n st r o l 菌株的全基因组测序 结果显示 该菌株中含有8 类至少4 0 个毒素基因 是目前已完成了全基因组测 序的细菌中含有杀虫毒素基因种类和数量最多的菌株 d u c h a u de ta 2 0 0 3 有 些共生菌毒素基因已被成功转入植物并显示出良好的抗虫活性 l i ue ta 1 2 0 0 3 共生菌很可能成为继苏云金杆菌之后开发转基因抗虫植物的毒素基因源 在抗生 素方面 已从共生菌中分离到属于二苯乙烯 苯毗哺 双硫吡咯酮或吲哚类衍生 物 对多种植物或人类病原细菌或真菌有较强抑杀作用的有机小分子类物质多 种 其中有些很有希望开发成新一代医用或农用抗生素 最近还从共生菌代谢产 物中分离到有抗癌 消炎和抗一些自身免疫病作用的物质 引起人们从共生菌次 生代谢产物中开发药物的兴趣 刘卫京等2 0 0 4 已有专门从事e n 共生菌药物 开发的公司 其中有些产品已进入临床试验阶段 h t t p w w w w e l i c h e m c o r n 不同种或品系的共生菌所产生的代谢产物有明显的不同 从共生菌新种或新 品系中找到新的有活性物质的可能性更大 积累共生菌种质资源和准确的分类是 进行其它有关研究的基础 近年来 本室在广东和云南等地采集分离到大量的昆 致病杆菌属三潜在新种的鉴定与描述 虫病原线虫及其共生菌 本研究综合采用了分子鉴定 生理生化测定和d n a d n a 杂交技术对本室在我国采集到的斯氏属昆虫病原线虫三个新种所携带共生 菌进行了鉴定与描述 为进一步研究和开发利用这三种线虫及其共生菌奠定了基 础 2 王闻中山大学硕士论文2 0 0 9 第一章昆虫病原线虫共生菌的研究概况 1 1 昆虫病原线虫 昆虫病原线虫 e n t o m o p a t h o g e n i en e m a t o d e se p n s 是一类体内携带共生细 菌的昆虫寄生性线虫 隶属于动物界线虫动物门 n e m a t o d a 尾感器纲 s e c e m e n t e a 小杆目 r h a b d i t i d a 包括斯氏线虫科 s t e i n e m e m a t i d a e 和 异小杆线虫科 h e t e r o r h a b d i t i d a e 其中斯氏线虫科包括两个属 即斯氏线虫属 s t e i n e r n e m a 和新斯氏线虫属 n e o s t e i n e r n e m a 异小杆线虫科包括一个属 即异小杆线虫属 h e t e r o r h a b d i t i s 丘雪红等2 0 0 7 该类线虫作为一种新型的 生物杀虫剂 能够防治鳞翅目 双翅目和鞘翅目等经济作物害虫 b u r n e l le ta 1 2 0 0 0 尤其是土壤害虫 k a y a e ta 1 9 9 3 g e o r g i se ta 1 1 9 9 4 寄主范围广 对 脊椎动物 植物和非靶标生物安全 对环境无负面影响 可以在昆虫体内外进行 大量培养 施用方便 能主动寻找寄主 在寄主中繁殖并快速杀死寄主 可与许 多化学和其他生物杀虫剂混用 可通过遗传选择获得想要的特性以及可直接利用 而无需注册 但是它们也会寄生在一些益虫体内 对环境变化的适应性弱 不能 长期储存以及价格比化学杀虫剂要高 h a z i re ta 1 2 0 0 4 尽管存在这些不足 但昆虫病原线虫作为生物防治试剂的前景依然较好 昆虫病原线虫在生物防治上的独特作用 受到科学和产业界高度重视 g a u g l e r 2 0 0 2 s t o c k 2 0 0 5 其中应用与研究最多的是斯氏属线虫和异小杆属线 虫 斯氏属线虫在自然环境中以感染期线虫的形式存活 该时期的线虫可在体外 存活好几个月而不摄入任何食物 并能主动寻找寄主昆虫 一旦侵入寄主昆虫 感染期线虫便在昆虫体内发育成三龄 四龄幼虫 进而发育成第一代成虫 第一 代成虫为雌雄异体 它们在昆虫体内产卵 当食物缺乏时 卵发育成一龄幼虫 一龄幼虫成长为二龄幼虫后直接进入感染期 当食物充足时 卵发育成一龄幼虫 一龄幼虫进而成长为二龄 三龄 四龄幼虫 最终成为成虫 这种周期可循环3 3 致病杆菌属三潜在新种的鉴定与描述 一4 次 一旦食物耗尽 便发生上述相似的过程以感染期线虫的形式从寄主中出 来 异小杆线虫属生活周期与斯氏线虫属类似 不同的是其第一代线虫为雌雄同 体 图1 1 摘自w o u t s1 9 8 0 是斯氏线虫属的一个种 s c a p t e r i s c i 的生活周期 其他种的生活周期和它类似 s h o r tc y c i e f o o d 轼 a 脱 i j 一九憎呦 竺幻 圳 k l f t m n e g g 蛳 s t o p i 一 j 2 j 1 剑嬲警 砬竺曼 脯 竺竺 一 咖c y c l ei f o o dp i e n t u 1 图1 1 斯氏线虫属的生活周期 j 1 j 2 j 3 j 4 一龄 二龄 三龄 四龄幼虫 u 感染期幼虫 p l 前感染期幼虫 g 1 g 2 分别为第一 第二代成虫 f i g 1 ll i f ec y c l eo f s t e i n e r n e m a j l j 2 j 3 j 4 f i r s t s e c o n d t h i r da n df o u r t hs t a g ej u v e n i l e i j i n f e c t i v ej u v e n i l e p i p r e i n f e c t i v ej u v e n i l e g i g 2 f i r s ta n ds e c o n dg e n e r a t i o na d u l t s 1 2 昆虫病原线虫共生菌 1 2 1 概况 4 王闻中山大学硕士论文 2 0 0 9 昆虫病原线虫共生菌是一类与昆虫病原线虫专一共生的细菌 属于变形菌门 p r o t e o b a c t e r i a y 变形菌亚门 y s u b c l a s so fp r o t e o b a c t e r i a 肠杆菌科 e n t e r o b a c t e r i a c e a e 有两个属 致病杆菌属 x e n o r h a b d u s 和发光杆菌属 p h o t o r h a b d u s a d a m se ta 1 2 0 0 6 其中致病杆菌属细菌与斯氏属线虫共生 发光杆菌属细菌与异小杆属线虫共生 t h o m a s p o i n a r1 9 7 9 a k h u r s t1 9 8 3 b 致病杆菌属和发光杆菌属细菌具有的共同特征是 革兰氏阴性杆菌 不产孢子 兼性厌氧 具有运动性 细胞平均大小为0 8 2 4 1 0p m t h o m a s p o i n a r 1 9 7 9 营化学有机营养 具有氧化酶活性 f o r s te ta 1 9 9 7 存在两种型态 o w u a m a2 0 0 1 不能还原硝酸盐 f a r m e re ta 1 1 9 8 9 大部分菌株是溶原性 细菌 在丝裂霉素c 或高温的诱导下会产生少量的噬菌体和细菌素 b o e m a r ee t 讲 1 9 9 2 不同的是 致病杆菌属无过氧化氢酶活性 而发光杆菌属有过氧化氢 酶活性 能产生荧光 t h o m a s p o i n a r1 9 7 9 1 2 2 致病杆菌属和发光杆菌属的特征 1 2 2 1 致病杆菌属的特征 不产孢子 杆状细胞 o 3 2 2 1 0r t m 革兰氏染色阴性 兼性厌氧 具有呼吸和发酵两种代谢类型 适宜的生长温度通常是2 8 或低于2 8 一些 菌能在4 0 生长 能以葡萄糖产酸 难以发酵一些其他的碳水化合物 过氧化 氢酶阴性 硝酸盐不能被还原为亚硝酸盐 该属对用于鉴定肠杆菌科的大部分测 试显示为阴性 在生长稳定期 培养物有两种型态 即i 型和l i 型 i 型培养物 能吸收色素 产生抗生素 产生晶状包涵体 以周生鞭毛运动 可以在o 6 一 1 2 的琼脂中游动 在蛋黄琼脂中培养能产生透明圈 即具有卵磷脂酶活性 大部分菌株都呈现出d n a 酶和蛋白酶活性 l i 型培养物不能吸收色素 不产生 抗生素 蛋白质包涵体和不具有其他一些i 型所拥有的特征 用t w e e n 2 0 检测 其具有脂酶活性 并且大部分菌株能水解t w e e n 4 0 6 0 8 0 和8 5 l i 型的脂酶 反应比i 型强 一些i i 型菌能运动 这一特性在i 型菌中较为普遍 t h o m a se t a 1 1 9 7 9 b o e m a r e a k h u r s t1 9 8 8 g i v a u d a ne ta 1 1 9 9 5 致病杆菌属三潜在新种的鉴定与描述 1 2 2 2 发光杆菌属的特征 b o e m a r ee ta 1 1 9 9 3 不产孢子 杆状细胞 0 5 2 1 1 0t t m 革兰氏染色阴性 以周生鞭毛 运动 兼性厌氧 同时有呼吸和发酵两种代谢类型 适宜的生长温度为2 8 2 一些菌能在3 7 3 8 2 生长 所有菌株具有过氧化氢酶活性 但不能还原硝酸盐 对肠杆菌科的大部分特性都显示为阴性 能水解明胶 大部分菌株能溶解羊血和 马血 一些菌于2 5 2 在羊血平板上培养可产生不寻常的环状噬血圈 所有菌能 水解t w e e n 2 0 即具有脂酶活性 大部分菌能水解t w e e n 4 0 6 0 8 0 和8 5 可 利用葡萄糖产酸但不产气 还可利用果糖 d 一甘露糖 麦芽糖 核糖和n 一乙 酰葡萄糖胺产酸 甘油发酵呈弱阳性 延胡索酸盐 琥珀酸盐 葡萄糖胺 l 一 谷氨酸盐 l 一苹果酸盐 l 一脯氨酸和l 一酪氨酸能被作为唯一碳源和能源 型 态变化发生在次级培养中 诱发产生i i 型 型态i 为自然环境中分离出来的野生 型 在稳定期能产生原生质晶体 在细胞中占很高比例 5 0 8 0 产荧光 通常能在黑暗的环境中观察到 在一些分离物中 种间和种内的亮度变化只能通 过光度计或闪烁计数仪才能检测到 在1 5 0 个已报道的菌株中只有一个分离物不 产荧光 型态i 产生的荧光强度比型态h 强 型态i 在n a 板尤其是营养丰富的 培养基中能产生粉红色 红色 橙色 黄色或绿色菌落 i i 型很少能产色素或产 生一种不同的色素 型态i i 在m a c c o n k e y 板上不吸收中性红 不产抗生素 1 2 3 与昆虫病原线虫的共生性 共生菌与昆虫病原线虫专一性共生 致病杆菌属细菌与斯氏属线虫共生 存 在于斯氏属感染期线虫特化的肠道囊膜中 b i r de ta 1 1 9 8 3 发光杆菌属细菌与 异小杆属线虫共生 存在于异小杆属感染期线虫的整个肠道 主要集中于肠道前 端 p o i n a r1 9 9 0 在自然条件下 一种线虫只携带一种共生菌 但某些种类的 共生菌可与几种线虫共生 a k h u r s t1 9 8 2 1 9 8 3 a a k h u r s t b o e m a r e19 9 0 感染期线虫携带共生菌通过昆虫幼虫的自然开口 如口 肛门和气孔进入昆 虫体内 异小杆线虫属的线虫还可通过节间膜进入 p o i n a r1 9 7 9 b e d d i n g m o l y n e u x1 9 8 2 在昆虫体内 线虫能够释放一些抑制昆虫免疫系统的物质 保 护共生菌免受宿主免疫系统的攻击 并将共生菌释放到昆虫血腔中 斯氏属线虫 通过排便的方式将致病杆菌属的细菌释放出来 m a r t e n se la 1 2 0 0 3 w o u t s1 9 9 1 6 王闻 中山大学硕士论文 2 0 0 9 而异小杆属线虫通过外吐的方式释放发光杆菌属细菌 c i c h e e n s i g n2 0 0 3 共生菌被释放后 致病杆菌属细菌会以自身细胞壁中主要成分是脂多糖的内毒素 溶解血腔 b r i l l a r de t 讲 2 0 0 1 d u n p h y t h u r s t o n19 9 0 发光杆菌属细菌在感染 早期会在血腔中大量繁殖 进一步破坏宿主昆虫的免疫系统 感染后期破坏昆虫 中肠上皮细胞 将昆虫脂肪组织等大分子物质转化为小分子物质 b o w e ne ta 1 9 9 8 s i l v ae ta 1 2 0 0 2 使昆虫患败血症死亡 此外 在感染后期 两个属的细 菌都会产生一系列的抗微生物物质 如细菌素等 阻遏不同种类的细菌 酵母和 真菌在虫尸上繁殖 保证自身繁殖和线虫的发育繁殖所需营养 a k h t t r s t1 9 8 2 b o e m a r ee ta 1 19 9 7 t h a l e re ta 1 19 9 5 线虫通过取食共生菌和由脂肪组织等大 分子物质转化来的小分子物质在虫尸内繁殖l 一3 代 一旦食物耗尽 线虫就会 发育进入感染期并携带共生菌从虫尸内出来寻找新的宿主 a d a m se ta 1 2 0 0 6 共生菌与线虫的共生机制一直是研究的热点 虽然还未能从根本上解释这种 机制 但近期一些研究结果表明共生菌与线虫之间的共生性可能与某些基因有 关 如c p x r a 基因 当该基因突变或缺失时 共生菌很难定植于宿主线虫中 h e r b e r te ta 1 2 0 0 7 共生菌与线虫之间种的专一性共生可能与某个单一的基因 座有关 如xn e m a t o p h i l a 在自然条件下和 c a r p o c a p s a e 专一性共生就与x n e m a t o p h i l a 中的耐i a n i l b 和n i l c 基因有关 其他菌种因缺乏该类基因而不能 与 c a r p o c a p s a e 共生 通过导入该类基因 其他菌种也能与 c a r p o c a p s a e 共 生 c o w l e se la 1 2 0 0 8 随着研究的深入以及分子生物学研究手段的应用 从本 质上揭示共生菌与线虫的共生机制成为可能 1 2 4 型变 致病杆菌属和发光杆菌属细菌存在型变现象 产生两种型态 分别为i 型 或 初生型 和1 i 型 或次生型 a k h u r s t1 9 8 0 d y b v i g1 9 9 3 这两种型态都能从 感染期线虫中分离得到 e h l e r se ta 1 1 9 9 0 但是线虫更倾向于携带初生型 因 为初生型更能保证线虫的繁殖 提供线虫繁殖所需营养物质 s m i g i e l s k ie t a 19 9 4 v o l g y ie ta 1 19 9 8 初生型更适应体内环境 而次生型更适应体外培养环 境 s m i g i e l s k ie ta 1 1 9 9 4 此外 有些共生菌还会出现其他的型态 g e r r i t s e ne t a 1 9 9 2 初生型与次生型的主要区别见表1 1 o w u a m a2 0 0 1 7 致病杆菌属三潜在新种的鉴定与描述 表1 1 昆虫病原线虫共生菌初生型与次生型的比较 t a b l e1 1p h a s ec h a r a c t e r so fs y m b i o t i c a lb a c t e r i ao fe p n s 型变这一现象在多种细菌中都会发生 如沙门氏菌 s a l m o n e l l as p p 因为 一段染色体片段的倒置产生两种不同鞭毛类型 b r u i s te t 讲 1 9 8 4 l i n o 甜a 1 9 8 3 链霉菌 s t r e p t o m y c e ss p p 会因为基因缺失或转座子的插入而发生型变 这些型变的发生与基因的变化密切相关 d y s o ne t 口 1 9 8 7 l e b l o n de ta i 1 9 8 9 但是 昆虫病原线虫共生菌的型变并不是由于基因的变化所致 通过对两种型态 的共生菌d n a 图谱分析 发现两型菌d n a 具有1 0 0 的同源性 a k h u r s t b o c m a r e1 9 9 4 这种型变也不是外源基因如质粒引起的 c o u c h ee ta 1 9 8 7 l e c l e r c b o c m a r e1 9 9 1 s m i g i e l s k i 等 1 9 9 4 研究发现 环境因子可增强共 生菌的型变 如营养 氧气和渗透压等 静止培养和厌氧罐培养更容易产生型变 b o c m a r e a k h u r s t1 9 9 0 a k h u r s t1 9 8 0 低渗透压更容易引起型态i 转变为型 态i i k r a s o m i l o s t e r f e l d1 9 9 5 这些研究表明共生菌的型变可能与基因无关 而可能与一些调控蛋白有关 是一种外在的调控 v a nd e rw o u d ee ta 1 9 9 6 h e n d e r s o n 甜a 1 9 9 9 具体的型变机制还需要通过进一步研究才能最终阐明 s 王闻中山大学硕士论文 1 2 5 致病性 共生菌与线虫的共生通常是它具有致病性的前提 a k h u r s t1 9 8 2 g e r r i t s e n s m i t s1 9 9 3 共生菌被感染期线虫携带进入昆虫体内 通常在侵入的5 小时内被 释放到血腔中 释放之初共生菌被昆虫的血细胞包被 但随后共生菌使血细胞丧 失活性 b r e h e l i ne 耐 1 9 9 3 这时细菌就以血腔中的物质为营养进行繁殖 破 坏昆虫血腔 产生多种代谢物质 在4 8 小时内杀死昆虫并保护昆虫尸体不被其 他微生物侵入 以保证线虫生长发育所需营养 b a l c e r z a k19 9 1 a k h u r s t d u n p h y 1 9 9 3 通过研究发现 昆虫病原线虫共生菌的致病性与多种因素有关 如共生菌对 昆虫免疫的防御机制 共生菌产生的内毒素 外毒素 一些胞外酶及其他次生代 谢物等对昆虫的杀伤作用 王立霞等2 0 0 0 1 共生菌对昆虫免疫的防御机制 共生菌能产生一些活性溶血因子破坏昆虫血腔中具有免疫活性的细胞 如粒细 胞 血细胞等 b r i l l a r de ta 1 2 0 0 1 从而削弱昆虫的细胞免疫 还可合成一些化 合物抑制昆虫宿主细胞中磷脂酶a 2 的活性 导致类二十烷酸的合成受阻 从而 抑制结节形成 避免被宿主细胞清除 p a r ke ta 1 2 0 0 3 a b 2 0 0 4 2 共生菌产 生的内毒素 外毒素 一些胞外酶及其他次生代谢物等对昆虫有杀伤作用 b o w e n 等 19 9 8 发现 t c 类杀虫毒素对鳞翅目昆虫烟草天眦a n d u c as e x l a 的初孵幼虫 具有e l 服杀虫活性 我室 崔龙等2 0 0 3 从xn e m a t o p h i l u sb p 品系中克隆出具 有杀虫活性的x p t 毒素 g i a n n o u l i s 等 2 0 0 8 发现共生菌的细胞壁成分脂多糖主 要是类脂a 能够促进血细胞破坏 加速细菌的释放 具有抑制和增强多酚氧化酶 的双重作用 k h a n d e l w a l 等 2 0 0 3 2 0 0 4 发现 n e m a t o p h i l u s 会分泌一种外膜泡 其中含有多种蛋白质和多肽 对昆虫幼虫具有口服毒性 同时从该菌外膜囊中分 离出1 7k d a 的细胞毒性蛋白质亚基 它可粘附在血细胞表面 使细胞凝集 j o s h i 2 0 0 8 等也从xn e m a t o p h i l u s 夕l 膜囊中分离出5 8k d ag r o e l 同源蛋白 对昆虫 幼虫具有口服毒性 还有很多共生菌代谢产物具有相似的功能 它们在杀虫方面的作用 引起研 究者们的广泛关注 通过对这些代谢产物的研究 可以开发出一些有应用价值的 抗生素农药 从而拓宽生物农药的应用范围 在生物防治上发挥重要作用 9 致病杆菌属三潜在新种的鉴定与描述 1 2 6 分类概况 1 2 6 1 共生菌分类研究历史 1 9 5 9 年 d u t 坶发现线曲v e o a p l e c t a n ac a r p o c a p s a ed d 1 3 6 现名 s t e i n e r n e m a c a r l c a p s a e 体内存在一株具有抑菌活性和防止昆虫尸体腐败的细菌 但他当时 并没有对其进行描述和命名 直至1 1 9 6 5 年 该菌的形态及生理生化特征才由p i o n a r 和t h o m a s 描述 通过他们的研究 该菌被归在肠杆菌科 e n t e r o b a c t e f i a e e a e 无 色杆菌 a c h r o m o b a c t e r 属 被命名为a c h r o m o b a c t e rn e m a t o p h i l u s 19 7 4 年 根 据h e n d r i e 等的描述 无色杆菌属 a c h r o m o b a c t e r 被取消 其属内的菌株被转 移到产碱杆菌属 a l c a l i g e n e s 或其他属 而共生菌却没有找到合适的归属 没 有合法的名字 这种状况一直持续至1 j 1 9 7 9 年 这年t h o m a s 和p o i n a r t 自r n t e r n a t i o n a l j o u r n a lo f s y s t e m a t i cb a c t e r i o l o g y 现名 i n t e r n a t i o n a lj o u r n a lo f s y s t e m a t i ca n d e v o l u t i o n a r ym i c r o b i o l o g y 上发表了一篇论文 其中详细描述了共生菌的形态和 生理生化特征 发现其与肠杆菌科的其他属种的大部分生理生化特征相同 只有 少数特征有明显差异 因此他们将共生菌归在肠杆菌科下的一个新属 命名为致 病杆菌属 x e n o r h a b d u s 当时仅包含两个种xn e m a t o p h i l a 和 l u m i n e s c e n s 也 就在这时他们认识到xn e m a t o p h i l a 只能从线虫属n e o a p l e c t a n a d p 分离得到 而x l u m i n e s c e n s 只能从线虫属h e t e r o r h a b d i t i s 中分离获得 1 9 8 3 年 a k h u r s t 1 9 8 3 b 根据形态和生理生化特征以及对d n ag c 含量的测定 将xn e m a t o p h i l a 下的菌株 分成3 个亚种 xn e m a t o p h i l as u b s p n e m a t o p h i l a xn e m a t o p h i l a 蛐b s p p o i n a n i 和xn e m a t o p h i l as u b s p b o v i e n i i 随着对共生菌研究的逐步深入和更多数据的积 累以及d n a d n a 杂交技术在共生菌种间分类上的应用 共生菌的分类研究取 得了很大的进展 a k h u r s t 等 19 8 8 采用数值分类的方法将xn e m a t o p h i l a 的亚 种提升为种 此时娩加砌6 访 洧5 个种 xn e m a t o p h i l a xp o i n a r i i zb o v i e n i i x b e d d i n g i i j f l d xl u m i n e s c e n s 由于xl u m i n e s c e n s e j x e n o r h a b d u s 属的其他种之间 存在某些表型特征的明显差异 b o e m a r ee t a 1 9 9 3 而且通过d n a d n a 杂交 分析发现 xl u m i n e s c e n s 与x e n o r h a b d u s 属的其他种之间存在比较低的同源性 因此b o e m a r e 等将其t a x e n o r h a b d u s 属中分出来 独立成为一个新属p h o t o r h a b d u s 1 0 王闻中山大学硕士论文 1 262 共生菌分类研究现状 虽然核苷酸编码分析 e h l e r se ta 1 1 9 8 8 以及1 6 sr d n a 序列分析显示 r a i n e y e t 讲 1 9 9 5 共生菌应归在y 变形菌亚门 但是对于共生菌的归属仍 然存在 些分歧 j a n s e 和s m i t s 1 9 9 0 通过对共生菌细胞全脂肪酸分析发现 共生菌细胞中存在肠杆菌科很少含有的支链和羟基化的脂肪酸 而且在某些形态 特征上也与肠杆菌科存在差异 因此对将其放在肠杆菌科下表示质疑 肠杆菌科 的属种具有还原硝酸盐活性和过氧化氢酶活性 f a r m e r 1 9 8 4 1 9 8 9 等根据致 病杆菌属不具有这些活性而对将其归属肠杆菌科产生怀疑 同时他们还注意到发 光杆菌属也不具有硝酸盐还原活性 而且该属还能产生色素和荧光 这些特征在 肠杆菌科中是很少见的 总d n a 杂交实验结果表明 x e n o r h a b d u s 属和大肠杆菌 ec o l d 的总d n a 仅存在4 的同源性 f a r m e r1 9 7 9 但在某些功能基因上 却具有很高的同源性 如 编码p n p 和r p s o 蛋白的d n a 序列与ec o l i 的编码区具 有7 5 的同源性 此外 它们在编码序列的相似性 基因组的调控以及编码蛋白 的特性等方面也存在较大的一致性 这就说明在肠n o r h a b d u s 和p h o t o r h a b d u s 中的 许多基因与ec o l i 具有很高的同源性 仅在非编码区之间存在差异 虽然共生茵 在某些方面与肠杆菌科的其他成员存在差异 但将其作为肠杆菌科下的一类特殊 群体得到了普遍承认 伯杰氏系统细菌学手册 第九版也将其归在肠杆菌科下 庞在堂 杨怀文2 0 0 3 不仅共生菌归属于肠杆菌科存在争论 而且将娩n o r h a b d u s 分为两个属也存 在一些分歧 b o e m a r e 等 1 9 9 3 通过d n a d n a 杂交实验发现 xl u m i n e s c e n s 与x e n o r h a b d u s 属的其他菌株的同源性不超过2 0 再结合表型特征 如生物荧 光 过氧化氢酶活性以及它不能和斯氏线虫属共生的特点 将xl u m i n e s c e n s 从致 病杆菌属中分离出来而独立成为一个属 而s t a c k e b r a n d t 和g o e b e l 1 9 9 4 指出 d n a d n a 杂交适用于种的分类而不适用于属 r a i n e y 等 1 9 9 5 通过1 6 sr d n a 序列的比较分析 发现很难将共生菌划归为两个属 这些分歧的产生可能是由于 所选方法本身存在缺陷所致 这就要求我们要采用多种方法综合分析 如对于1 6 s r d n a 在共生菌分类上存在的一些不足 我们可通过发掘一些可靠的分子标记来 弥补它的缺陷 同时不断增加两个属的菌株序列数 得到更加可靠的系统发育关 系 因此 在细菌分类上要结合形态和生理生化特性 1 6 sr d n a 全序列分析和 致病杆菌属三潜在新种的鉴定与描述 d n a d n a 杂交结果 才能得出可靠的分类结果 s t a c k e b r a n d te ta 2 0 0 2 目前 根据共生菌形态和生理生化特性 1 6 sr d n a 全序列分析 d n a 分型 以及d n a d n a 杂交结果 把昆虫病原线虫共生菌划归为两个属 即 x e n o r h a b d u s 和p h o t o r h a b d u s 其锄o r h a b d u s 中已定名的种有2 0 它们是x n e m a t o p h i l a xp o i n a r i i xb o v i e n i i xb e d d i n g i i x j a p o n i c a xi n d i c a x b u d a p e s t e n s i s xe h l e r s i i xi n n e x i xs z e n t i r m a i i xc a b a n i l l a s i i xd o u c e t i a e xg r i f f i n i a e xh o m i n i c k i i xk o p p e n h o e f e r i xk o z o d o i i xm a u l e o n i i x m i r a n i e n s i s xr o m a n i i 和xs t o c k i a e p h o t o r h a b d u s 中已定名的种有3 个 s a u xe ta 1 19 9 9 它们匙l u m i n e s c e n s pt e m p e r a t a 和pa s y m b i o t i c a 其中pl u m i n e s c e n s 有五个亚种 e p rl u m i n e s c e n ss u b s p 1 u m i n e s c e n s 旦l u m i n e s c e n ss u b s p a k h u r s t i i pl u m i n e s c e n ss u b s p 1 a u m o n d i i pl u m i n e s c e n ss u b