（农产品加工及贮藏工程专业论文）γ氨基丁酸和头孢曲松钠脂质体制备技术的研究.pdf

_ j 1 目录 目录 中文摘要i 英文摘要。i i l 1 前言。1 1 1 概述脂质体1 1 1 1 脂质体的定义l 1 1 2 脂质体的组成与结构。1 1 1 3 脂质体的分类2 1 1 4 脂质体的特点。2 1 1 5 国内外脂质体制备方法的研究进展3 1 1 6 脂质体的应用_ 5 1 2 预载的生物活性物质7 1 2 11 ，氨基丁酸7 1 2 2 头孢曲松钠。8 1 3 本研究的目的与意义9 2 材料与方法1 0 2 1 仪器1 0 2 2 材料1 0 2 3y 氨基丁酸脂质体制备及稳定性研究的试验方法1 1 2 3 1y 氨基丁酸检测方法的确立1 l 2 3 21 ，氨基丁酸标准曲线的绘制1 1 2 3 3 p 氨基丁酸标准液精密度。l l 2 3 4 丫氨基丁酸脂质体包封率测定方法的回收率试验。1 1 2 3 5t 氨基丁酸脂质体包封率的测定。1 l 2 3 61 f 氨基丁酸脂质体制备方法的筛选。1 2 2 3 7 醋酸钙梯度法制备y 氨基丁酸脂质体的单因素试验1 2 2 3 8 正交设计确定丫氨基丁酸脂质体的最佳制备方法1 3 2 3 9y 氨基丁酸脂质体的形态观察1 3 2 3 1 0y 氨基丁酸脂质体稳定性的研究1 4 2 4 头孢曲松钠脂质体制备及稳定性研究的试验方法1 5 2 4 1 头孢曲松钠检测波长的确立1 5 2 4 2 头孢曲松钠标准曲线的绘制1 5 2 4 3 头孢曲松钠标准液的精密度1 5 2 4 4 头孢曲松钠脂质体包封率测定方法的选择15 2 4 5 头孢曲松钠脂质体包封率测定方法回收率的试验1 6 2 4 6 头孢曲松钠脂质体包封率的测定1 6 2 4 7 头孢曲松钠脂质体制备方法的选择1 6 l 噜- i i 东北农业大学农学硕士学位论文 2 4 8 逆相蒸发法制各头孢曲松钠脂质体的单因素试验1 7 2 4 9 正交试验设计优化头孢曲松钠脂质体制备条件1 7 2 4 1 0 头孢曲松钠脂质体的外观。1 8 2 4 1 l 头孢曲松钠脂质体的形态观察1 8 2 4 1 2 头孢曲松钠脂质体的泄漏率。1 8 2 4 1 3 头孢曲松钠脂质体磷脂的氧化程度1 8 3 结果与分析1 9 3 1 丫一氨基丁酸脂质体制备及稳定性研究的试验结果。1 9 3 1 1 丫一氨基丁酸检测方法的确立。1 9 3 1 2 丫- 氨基丁酸的标准曲线1 9 3 1 3 r - 氨基丁酸标准液精密度试验结果。2 0 3 1 4t 氨基丁酸脂质体包封率测定方法的回收率试验结果。2 0 3 1 5y 氨基丁酸脂质体制备方法的筛选结果。2 0 3 1 6 醋酸钙梯度法制备丫氨基丁酸脂质体的单因素试验2 l 3 1 7 正交设计试验优化丫一氨基丁酸脂质体的制备条件。2 3 3 1 8 十氨基丁酸脂质体的形态观察。2 4 3 1 。9y 氨基丁酸脂质体稳定性的研究。2 4 3 2 头孢曲松钠脂质体制备及稳定性研究的试验结果。2 6 3 2 1 头孢曲松钠检测波长的确立2 6 3 2 2 头孢曲松钠的标准曲线2 6 3 2 3 头孢曲松钠标准液的精密度试验2 7 3 2 4 头孢曲松钠包封率测定方法的选择2 7 3 2 5 头孢曲松钠包封率测定方法回收率的试验2 7 3 2 6 头孢曲松钠脂质体制各方法的选择结果2 7 3 2 7 逆相蒸发法制备头孢曲松钠脂质体的单因素试验2 8 3 2 8 正交试验设计优化头孢曲松钠脂质体制备条件3 0 3 2 9 头孢曲松钠脂质体脂质体外观3 0 3 2 1 0 头孢曲松钠的形态观察3 1 3 2 1 l 脂质体的泄漏率。3 l 3 2 1 2 脂质体磷脂的氧化程度3 2 4 讨论3 3 4 1 丫- 氨基丁酸脂质体脂质体制备方法的筛选3 3 4 2 醋酸钙法制备脂质体的机制3 3 4 3 制备y - 氨基丁酸脂质体的单因素试验3 3 4 3 1 醋酸钙浓度3 3 4 3 2 药脂比3 4 4 3 3 卵磷脂与胆固醇的质量比3 4 4 3 4 孵育温度3 4 1l - 目录 4 3 5 孵育时间3 5 5 结论。3 6 致澍3 7 参考文献。3 8 攻读学位期间发表的学术论文4 4 l _，i_-一 c o n t e n t s c o n t e n t s c h i n e s ea b s t r a c t i e n g l i s ha b s t r a c t i i i ip r e f a c e 1 1 1o v e r v i e wo f l i p o s o m e 1 1 1 1d e s c r i p t i o no fl i p o s o m e 1 1 1 2c o m p o s i t i o na n dc o n s i t i t u s i o no fl i p o s o m e 1 1 1 3c a t e g o r i z a t i o no f l i p o s o m e 2 i 1 4c h a r a c t e ro f l i p o s o m e 2 1 1 5r e s e a r c hp r o g r e s s i o no f p r e p a r a t i v em e t h o d so f l i p o s o m ei nt h ew o r l d 3 1 1 6a p p l i c a t i o no fl i p o s o m e 5 1 2b i o a c t i v ec o m p o u n df o re n c a p s u l a t i o n 7 1 2 17 - a m i n o b u t y r i ca c i d 7 1 2 2c e f l r i a x o n es o d i u m 8 1 3p u r p o s ea n ds i g i n i f i e a n c eo f t h es t u d y 9 2m a t e f i a la n dm e t h o d 1 0 2 1a p p a r a t u s 。1 0 2 2m a t e r i a l 1 0 2 3s t u d yo nt h ep r e p a r a t i o na n ds t a b i l i t yo f a m i n o b u t y r i ca c i d 11 2 3 1e s t a b l i s ho f d e t e c t i o n a lm e t h o do f 7 一a m i n o b u t y r i ca c i d 1 1 2 3 2d r a w i n go f s t a n d a r dc r u v e 11 2 3 3d e g r e eo f p r e c i s i o n 1 1 2 3 4r e c o v e r ye x p e r i m e n to f t h ea s s a yo f e m b e d d i n gr a t e 11 2 3 5a s s a yo fe m b e d d i n gr a t e 11 2 3 6b o l t i n go f t h ep r e p a r a t i o n a im e t h o d so f l i p o s o m e 1 2 2 3 7 s i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t so fl i p o s o m ep r e p a r a t i o nb yc a l c i u ma c e t a t eg r a d i e n tm e t h o d1 2 2 3 8o r t h o g o n a ld e s i g ne x p e r i m e n t 1 3 2 3 9o b s e r v a t i o no f 7 a m i n o b u t y f i ca c i di i p o s o m e sa p p e a r a n c e 1 3 2 3 1 0s t u d yo nt h es t a b i l i t yo f 7 - a m i n o b u t y r i ca c i dl i p o s o m e 。1 4 2 4s t u d yo f t h ep r e p a r a t i o na n ds t a b i l i t yo fc e f l r i a x o n es o d i u ml i p o s o m e 15 2 4 1e n s t a b l i s h m e n to fc e f t r i a x o n es o d i u ml i p o s o m e d e t e c t i v ew a v el e n g t h 15 2 4 2d r a w i n go f s t a n d a r dc r t l v e 1 5 2 4 3d e g r e eo f p r e c i s e 1 5 2 4 4s e l e c t i o no f a s s a ym e t h o do f e m b e d d i n gr a t e 1 5 2 4 5e x p e r i m e n to f r e c o v e r yr a t eb ye m b e d d i n gr a t em e t h o d 1 6 2 4 6a s s a yo f e m b e d d i n gr a t e 1 6 2 4 7s e l e c t i o no fl i p o s o m e sp r e p a r a t i o n a lm e t h o d 1 6 v 皤k 东北农业大学农学硕士学位论文 2 4 8a n t i p h r a s ee v a p a r a t i o nm e t h o d 1 7 2 4 9o r t h o g o n a le x p e r i m e n tt oo p t i m i z et h ec o n d i t i o no fc e f t r i a x o n es o d i u ml i p o s o m e s p r e p a r a t i o n 1 7 2 4 1 0s h a p eo f l i p o s o m e 1 8 2 4 1 1o b s e r v a t i o no f l i p o s o m ea p p e a r a n c e 1 8 2 4 1 2s p i l lr a t eo f l i p o s o m e 1 8 2 4 1 3o x i d a t i o nd e g r e eo fl i p o s o m ep h o s p h o l i p i d 1 8 3r e s u l t sa n da n a l y s i s 1 9 3 1r e s u l t so f t h es t u d yo nt h ep r e p a r a t i o na n ds t a b i l i t yo f 7 - a m i n o b u t y r i ca c i d 19 3 1 1e s t a b l i s ho f d e t e c t i o n a lm e t h o do f r a m i n o b u t y r i ca c i d 1 9 3 1 。2d r a w i n go f s t a n d a r dc r u v e 。1 9 3 1 3d e g r e eo f p r e c i s i o n 。2 0 3 1 4r e c o v e r ye x p e r i m e n to f t h ea s s a yo f e m b e d d i n gr a t e 。2 0 3 1 5b o l t i n go f t h ep r e p a r a t i o n a lm e t h o d so fl i p o s o m e 2 0 3 1 6s i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t so fl i p o s o m ep r e p a r a t i o nb yc a l c i u ma c e t a t eg r a d i e n tm e t h o d 2 1 3 1 7o r t h o g o n a ld e s i g ne x p e r i m e n t 2 3 3 1 8o b s e r v a t i o no f 7 - a m i n o b u t y r i ca c i dl i p o s o m e sa p p e a r a n c e 。2 4 3 1 9s t u d yo i lt h es t a b i l i t yo f t a m i n o b u t y r i ca c i dl i p o s o m e 。2 4 3 2r e s u l t so ft h e s t u d y o nt h ep r e p a r a t i o na n ds t a b i l i t yo fc e f i r i a x o n es o d i u ml i p o s o m e 2 6 3 2 1e n s t a b l i s h m e n to f c e f t r i a x o n es o d i u ml i p o s o m e d e t e c t i v ew a v el e n g t h 2 6 3 2 2d r a w i n go f s t a n d a r dc r u v e 。2 6 3 2 3d e g r e eo f p r e c i s e 2 7 3 2 4s e l e c t i o no f a s s a ym e t h o do f e m b e d d i n gr a t e 2 7 3 2 5e x p e r i m e n to f r e c o v e r yr a t eb ye m b e d d i n gr a t em e t h o d 2 7 3 2 6s e l e c t i o no fl i p o s o m e sp r e p a r a t i o n a lm e t h o d 2 7 3 2 7a n t i p h r a s ee v a p a r a t i o nm e t h o d 2 8 3 2 8o r t h o g o n a le x p e r i m e n tt oo p t i m i z et h ec o n d i t i o no fc e f t r i a x o n es o d i u ml i p o s o m e s p r e p a r a t i o n 。3 0 3 2 9s h a p eo f l i p o s o m e 3 0 3 2 1 0o b s e r v a t i o no f l i p o s o m ea p p e a r a n c e 3 1 3 2 1 1s p i l lr a t eo f l i p o s o m e 。3 1 3 2 1 2o x i d a t i o nd e g r e eo fl i p o s o m ep h o s p h o l i p i d 3 2 4d i s s c u s i o n 3 3 4 1b o l t i n go ft h ep r e p a r a t i o n a lm e t h o d so fl i p o s o m e 3 3 4 2m e c h n i s mo fl i p o s o m ep r e p a r a t i o nb yc a l c i u ma c e t a t eg r a d i e n tm e t h o d 3 3 4 3s i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t so f t h ep r e p a r a t i o no fl i p o s o m e 3 3 4 3 1c o n c e n t r a t i o no fc a l c i u ma c e t a t e 3 3 _ 一 c o n t e n t s 4 3 2m e d i c i n e 1 e c t h i nr a t e 3 4 4 3 3l e c i t h i n - - c h o l e s t e r o lq u a l i t yr a t e 3 4 4 3 4i n c u b a t i o nt e m p e r a t u r e 3 4 4 3 5i n c u b a t i o nt i m e ：；! ； ! ；c o n c l u s i o n s 3 6 a e k n o w l e d g e m e n t s 3 7 r e f e r e n c e s 3 8 p u b l i s h e da r t i c l e sd u r i n gs p e c i a l i z i n gt h ed e g r e eo f m a s t e r 4 4 l ii 簟l i 研究生学位论文独创声明和使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 注；垫逡查基丝置噩挂别主明的：奎拦卫窒2 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均邑在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：到永砷 日期：如肜年月厂。e l 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 学位论文作者签名：刘弘译 日期：锣驴年锄刀日 导师 签名：弓饫永忠 日期：加，口年汨。e l 膏；j _1 i l 摘要 摘要 p 氨基丁酸是广泛分布于动植物中的一种非蛋白质氨基酸，也是哺乳动物脑、脊髓中的 抑制性神经传递物质。在人或动物体内，它参与脑循环生理活动，具有抑制血压上升，改善 脑机能，保护脑神经等诸多作用。头孢曲松钠为第三代头孢菌素，对绝大多数革兰氏阳性菌、 阴性菌十分敏感。它具有耐酶低毒、组织穿透力强及消除半衰期长等特点，是目前半衰期最 长的头孢菌素之一，在治疗下呼吸道、皮肤组织等感染及细菌性败血症方面并取得显著的疗 效。 本课题主要研究了少氨基丁酸脂质体和头孢曲松钠脂质体的制各工艺。在确立出脂质体 制备方法和包封率测定方法的基础上，采用单因素试验和四因素三水平正交试验设计对各因 素的水平进行筛选，通过极差分析，最终确定脂质体的最佳制备条件。 采用醋酸钙梯度法制备产氨基丁酸脂质体，单因素试验和正交试验的结合，确定的最佳 制备条件为：药脂比为1 ：2 0 ，卵磷脂与胆固醇的质量比为4 ：1 ，醋酸钙浓度为o 1 2 m o l l ，孵 育温度为5 0 。此条件下制得的脂质体平均包封率为9 1 4 ；采用逆相蒸发法制备头孢曲松 钠脂质体的最佳制备条件为：头孢曲松钠和卵磷脂的质量比为1 ：1 0 ，头孢曲松钠和胆固醇的 质量比为l ：4 ，孵育温度为5 5 ，水化介质( t r i s h c i 缓冲液) 加入量为2 0 m l ，此条件下制得 的脂质体平均包封率为31 2 6 。 通过透射电镜对脂质体进行显微形态观察，得到脂质体均为完整圆球形或椭圆形的球粒， 粒子分散较均匀。产氨基丁酸脂质体平均粒径为5 5 n m ，而头孢曲松钠脂质体平均粒径为 4 5 n m 。 在4 。c 和2 5 下，通过对脂质体外观形态观察和粒径、泄漏率、m d a 值的测定研究了 脂质体的物理、化学短期稳定性。经研究表明，在2 5 c 时，随着时间的增长，脂质体粒子会 聚集、融合，粒径增大，泄漏率增加，膜材磷脂有一定程度氧化，m d a 值增加；而在4 c 时， 则可明显抑制了脂质体的聚集、融合，减缓了所载物质的泄漏和m d a 值的增加，提高脂质 体的稳定性。 关键词脂质体；包封率；y - - 氨基丁酸：头孢曲松钠；稳定性 ，一 j - a b s t r a c t s t u d yo nt h ep r e p a r a t i o nt e c h n o l o g yo fy a m i n o b u t y r i c a c i da n dc e f t r i a x o n eso d i u ml i p o s o m e s a b s 仃a c t ? - a m i n o b u t y r i ca c i di sn o to n l yan o n - p r o t e i na m i n oa c i dw h i c hw i d e l yd i s t r i b u t e di np l a n t s a n da n i m a l sb u ta l s oi sa ni n h i b i t o r yn e u r o t r a n s m i t t e rt h a tp r e s e n ti nm a m m a l i a nb r a i na n ds p i n a l c o r d i nt h eh u m a no ra n i m a lb o d y ，i tc a nb eu s e da si n h i b i t o rt op r e v e n tt h er i s eo fb l o o dp r e s s u r e a n da l s oc a np r o t e c tb r a i na n di m p r o v eb r a i nf u n c t i o na n ds oo ni n v o l v e di np h y s i c a la c t i v i t i e si n c e r e b r a lc i r c u l a t i o n c e f t r i a x o n es o d i u m ，at h i r dg e n e r a t i o nc e p h a l o s p o r i n , w h i c hi sv e r ys e n s i t i v e t ot h ev a s tm a j o r i t yo fg r a m p o s i t i v eb a c t e r i aa n dn e g a t i v eb a c t e r i a , p e r s o n i f i c a t i o ns om a n y c h a r a c t e r i s t i c s ，s u c ha sl o wt o x i c i t ya n dr e s i s t a n c et oe n z y m e s ，s t r o n gp e n e t r a t i o ni nt i s s u ea n dl o n g e l i m i n a t i o no fh a l f - l i f e ，i so n eo fc e p h a l o s p o r i nt h a th a st h el o n g e s th a l f - l i f ec u r r e n t l y i th a s a c h i e v e ds i g n i f i c a n te f f e c ti nc l i n i c a l l yf o rt h et r e a t m e n to fi n f e c t i o ni nt h el o w e rr e s p i r a t o r yt r a c l a n ds k i na sw e l la si n b a c t e r i a ls e p t i c e m i a i nt h i s p a p e r , w em a i n l y s t u d i e do nt h ey - a m i n o b u t y r i ca c i dl i p o s o m ea n dc e f t r i a x o n e l i p o s o m e o nt h eb a s i so ft h em e t h o d sf o rp r e p a r i n gl i p o s o m ea n dm e a s u r i n ge n c a p s u l a t i o n , o n e - f a c t o rt e s t sa n df o u rf a c t o r s ，t h r e e l e v e lo r t h o g o n a le x p e r i m e n t a ld e s i g nw e r ec a r r i e do u tt o c h o o s et h el e v e lo fv a r i o u sf a c t o r s ，u s i n gt h er a n g ea n a l y s i st oo b t a i nt h eo p t i m a lp r e p a r a t i o n c o n d i t i o n so fl i p o s o m eu l t i m a t e l y t h ec a l c i u ma c e t a t eg r a d i e n tm e t h o da p p l i e dt op r e p a r ey - a m i n o b u t y r i ca c i dl i p o s o m e ，t h r o u g h t h ec o m b i n a t i o no fo n e - f a c t o rt e s t sa n do r t h o g o n a lt e s t s ，t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sw e r ed e t e r m i n e d a sf o l l o w e d ：y - a m i n o b u t y r i ca c i dl i p o s o m e e g gp h o s p h a t i d y lc h o l i n e ( e p c ) i ：2 0 。e g gp h o s p h a t i d y l c h o l i n e ( e p c ) c l e a r a n c e ( c l ) 4 ：1 ，c o n c e n t r a t i o no fc a l c i u ma c e t a t ew a so 1 2m o l l ，i n c u b a t i o n t e m p e r a t u r e5 0 u n d e rt h eo p t i m a lf o r m u l a t i o n y - a m i n o b u t y r i ca c i dl i p o s o m ew a se n c a p s u l a t e d 9 1 4 t h r o u g ht h er e v e r s e - p h a s e e v a p o r a t i o nm e t h o d o n eo p t i m u mr e c i p e so fc e t l r i a x o n e l i p o s o m ew a sf o u n dt h a ti ts h o w e dc e f t r i a x o n el i p o s o m e e p c1 ：10 ，c e f t d a x o n el i p o s o m e e p c1 ：4 ， i n c u b a t i o nt e m p e r a t u r e5 5 ，h y d r a t i o nm e d i u m ( t r i s h c ib u f f e r ) w a sa d d e db yt h ev o l u m eo f 2 0 m l ，u n d e rt h eo p t i m a lf o r m u l a t i o n ，c e f t r i a x o n el i p o s o m ew a se n c a p s u l a t e d31 2 6 t h el i p o s o m es h o w sp a r t i c a li nt h es h a p eo fp e l l e to re l l i p t i c a ls h a p ea n dd i s t r i b u t i o no fs i z e u n i f o r m i t yu n d e rt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y t h ea v e r a g ed i a m e t e ro fy - a m i n o b u t y r i ca c i d i i p o s o m ea n dc e f t r i a x o n el i p o s o m ea r ea b o u t5 5a ma n d4 5n mr e s p e c t i v e l y a t4 a n d2 5 ，t h ep h y s i c a la n dc h e m i c a ls t a b i l i t i e so fy - a m i n o b u t y r i ca c i da n d u i o i 东北农业大学农学硕二l 学位论文 c e f t r i a x o n el i p o s o m e sw e r ei n v e s t i g a t e db yo b s e r v i n gl i p o s o m em o r p h o l o g ya n dm e a s u r i n gt h e c h a n g e so fd i a m e t e r , l e a k a g er a t ea n dt h em a l o n d i a l d e h y d e ( m d a ) c o n t e n t a t2 5 ，w i t ht h et i m e g o i n gu p ，t h ep a r t i c a l sw o u l da s s e m b l e ，t h el e a k a g er a t ew o u l di n c r e a s ea n dt h el e c i t h i nw o u l db e o x i d a t e d ，m d aw o u l di n c r e a s ei nt h ev a l u e h o w e v e r , a t4 ，t h es t a b i l i t yo fl i p o s o m ec a nb e i m p r o v e ds u c ha si nt h ei n h i b i t i o nt h ea g g r e g a t i o no fl i p o s o m ea n ds l o w i n gd o w nt h el e a k a g eo f m a t e r i a lc o n t a i n e di nt h el i p o s o m ea sw e l la st h ei n c r e a s e i n gi nm d av a l u e s 一 簟 k e y w o r d s ：l i p o s o m e ，e n c a p s u l a t i o n ，y - a m i n o b u t y r i ea c i