（环境科学专业论文）壳聚糖及其表面活性剂复合物的抗菌性与抗菌机理的研究.pdf

死了1 2l o gc f u m l 的大肠杆菌，1 2 0 分钟内杀死全部的大肠杆菌与部分的金黄 色葡萄球菌；它对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌均有抑 制活性，m i c 值为o 0 2 5 0 0 5 ，但对白色念珠菌无抑制效果；酶解壳聚糖 产物的抗菌性随分子量的降低而有减弱的趋势，尤其是分子量小于1 0 0 0 0 的壳低 聚糖m i c 值下降1 倍：超声波降解壳聚糖的产物在分子量小且脱乙酰度高时 的抗菌性最强，且脱乙酰度相近的壳聚糖随分子量的降低其抗菌性增强，但分子 量相近的壳聚糖的抗菌性并不一定随脱乙酰度的增加而增强，这可能与样品本身 的分子结构有关；通过分析壳聚糖衍生物如羧甲基壳聚糖、壳聚糖季胺盐、 壳寡糖、壳聚糖亚硒酸盐、钠米壳聚糖与壳聚糖的季胺盐等的抗菌性认为，壳聚 糖的氨基对其抗菌性是至关重要的，能增强壳聚糖分子的电荷密度，促进其与带 负电荷的细菌表面的相互作用有利于抗菌性的增强，反之亦然。有机羧酸如苯 甲酸、水杨酸、抗坏血酸、柠檬酸与壳聚糖醋酸溶液混合后对细菌的抑菌时间增 长，o 0 5 壳聚糖醋酸溶液+ o 0 1 水杨酸溶液具有最强的抗菌性，p h 5 8 时混 合液对细菌有较强的抑制作用。 3 壳聚糖与表面活性剂分子间的相互作用：制备了壳聚糖与两性甜菜碱型 ( b e t a i n e ) 、非离子烷基多苷( h v g ) 、阴离子型十二烷基磺酸盐( s d s ) 与直链十 二烷基苯磺酸盐( l a s ) 的复合物，并用i r 、x r d 、热分析( t g 、d t g 、d s c ) 等方法表征了其结构，并用粘度法、g p c 法测定了复合溶液的g p c 谱图与特性 粘数( ) ，分析了壳聚糖与表面活性剂的相互作用。结果表明，壳聚糖在p h 1 2 0 h ，杀菌力也显著增强了，而且复合物溶液中壳聚 糖的浓度0 0 2 5 ， b e t a i d e 的浓度o 0 1 2 5 时，p h 5 8 时复合物的抗菌性 较强；资料显示，壳聚糖与s d s 复合物的表面活性比s d s 本身的表面活性增 强，实验结果表明壳聚糖与非离子型、两性表面活性剂的复合物仍能保持表面活 性功能，而且浓度低于最低胶束浓度( 1 0 4 1 0 4g m e ) 时，壳聚糖一a p g 复合 物的表面活性较a p g 略有增强。 5 壳聚糖与其表面活性剂复合物的抗菌机理：用透射电镜( t e m ) 观察了壳聚 糖处理的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细胞形态，通过测定细菌悬液的a 2 6 0 f 。 物质的泄露、胞内酶的外渗与荧光示踪法研究了壳聚糖对大肠杆菌与金黄色葡萄 球菌细胞膜完整性、大肠杆菌细胞外膜( o m ) 与内膜( i m ) 透性的影响，并制 各了模拟细胞双层磷脂膜，用u v s 、i r 、x r d 、热分析等方法研究了壳聚糖 与模拟细胞膜的相互作用，以揭示壳聚糖的抗菌机理。结果表明，对于大肠杆菌， 壳聚糖可以迅速与其o m 反应，使o m 呈锯齿状，失去其功能，同时使i m 透性 增加，最终造成整个细胞膜的完整性被破坏，d n a 等物质渗漏而死亡；对金黄 色葡萄球菌的抗菌性有两种机制：对于那些处于分裂期或是剐生成的细嫩细 胞，壳聚糖可能抑制了新细胞壁的生成，并破坏了分裂部位的细胞膜，使其破裂， 内容物流出而最终死亡；对于那些未处于分裂期的成熟细胞，壳聚糖只是聚 积在表面，这些细胞在短时间内很难被杀死，因而可能是通过抑制营养物质吸收 等而抑制其生长繁殖，以至最终凋亡。不管是对大肠杆菌还是对金黄色葡萄球菌， 能被壳聚糖快速杀死的都是由于其细胞膜受到破坏所致。壳聚糖与模拟细胞膜相 互作用的结果表明，壳聚糖确实能与磷脂膜迅速发生强烈的反应，这种反应是由 i l l 壳聚糖的氨基正离子与磷脂膜上的磷酸根通过静电作用生成复合物所致的。 通过总结壳聚糖的抗菌机理、壳聚糖与表面活性剂分子间相互作用与其抗菌 性的关系，提出了壳聚糖一表面活性剂复合物抗菌机理的模型。壳聚糖在醋酸溶 液中通常以聚集态的形式存在。当加入表面活性剂后，壳聚糖的氨基正离子或是 羟基可以与表面活性荆亲水基团发生相互作用，形成一种动态缔合体，其中壳聚 糖趋于解聚，且链构象趋于伸展。因此，与聚集体相比，虽然堋3 总量没变， 但分子链中能够接触到细胞膜的- n i - - 1 3 + 数量增加了。由于疏水作用，表面活性剂 的长链烷基倾向于渗透到疏水的细胞膜内部，因此将壳聚糖拉向带负电荷的磷脂 中的磷酸根基团，其后，壳聚糖氨基正离子会与磷酸根形成更强的离子键。通过 这种方式，壳聚糖与磷脂间的相互作用也被增强了。除此之外，表面活性剂烷基 基团向细胞膜内部的渗透也会干扰细胞膜的正常功能。由于以上原因，细胞膜更 易被破坏，因此这种动态缔台体的抗菌性增强了。 基于这种模型，可以推论，一个具有疏水与亲水基团的小分子，只要其亲水 基团能与壳聚糖氨基正离子形成氢键、离子键等非共价键，那么这个分子就能促 进壳聚糖的抗菌性。 本论文的创新点： 1 研究了酶水解、超声波降解及过氧化氢氧化降解壳聚糖产物的m w 对其 抗菌性的影响。结果显示，超声波降解与过氧化氢降解得到的壳低聚糖产物的抗 菌性比大m w 壳聚糖的抗菌性增强，m w 在1 5 4 1 0 4 9 1 1 0 4 范围内，小于 2 0 x1 0 4 的壳低聚糖对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的抑菌率均可达1 0 0 ，而酶水 解方法得到的壳低聚糖抗菌性低于大分子量的壳聚糖，丽其m i c 值可以降低1 倍。该结果表明不同降解方法得到的壳聚糖分子量与其抗菌性的关系，为壳聚糖 抗菌性的基础研究与实际应用提供了科学依据。为了进一步增强壳聚糖的抗菌 性，本文还研究了苯甲酸、水杨酸、抗坏血酸，柠檬酸对壳聚糖醋酸溶液抗菌性 的影响，并考察了配比、浓度、p h 值对混合溶液抗菌性的影响。结果表明，混 合溶液对细菌的抻菌时间增长，o 0 5 壳聚糖醋酸溶液十o 0 1 水杨酸具有较强的 抗菌性，p h 5 8 时混合液对细菌的抑制作用较强。有机酸与壳聚糖醋酸溶液的 复合，为增强壳聚糖的抗菌性及其应用提供了新的思路。 2 较系统性地研究了壳聚糖的抗菌机理阐明了壳聚糖在不同细菌上的作 【v 用位点，并针对不同种类、不同生长发育阶段的细菌提出了不同的抗菌机理。对 于大肠杆菌，壳聚糖主要破坏其外膜，从而使内膜的透性也增加，最终使整个细 胞膜失去功能；对于金黄色葡萄球菌，壳聚糖作用于幼嫩细胞刚生成部位和分裂 期细胞分裂部位的细胞膜，使其细胞膜破裂，内容物流出而快速死亡：对于成熟 的金黄色葡萄球菌细胞，壳聚糖只作用于表面，抑制细胞代谢和营养物质的吸收， 而减慢其生长与繁殖速度和最终凋亡。利用赢分子物理化学方法研究了壳聚糖分 子与模拟细胞膜之间的相互作用，证实了壳聚糖分子与细胞磷脂之间的静电作 用。这些结论为壳聚糖对不同菌的抗菌性机理提供了新的见解，同时也对其应用 及定向合成具有指导性的意义。 3 首次较系统地研究了壳聚糖一表面活性荆复合物的抗菌性及壳聚糖对非 离子型和两性表面活性剂表面活性的影响，并探讨了壳聚糖与表面活性剂复合物 的抗菌机理。结果显示，表面活性剂尤其是非离子型、两性表面活性剂与壳聚糖 醋酸溶液具有良好的相容性，复合后的抗菌活性大大提高，抗菌范围加宽，而且 还能保持原有的表面活性功能，为壳聚糖与表面活性剂复合物在诸多领域中的应 用奠定了基础。同时，研究了壳聚糖与两性、非离子型表面活性剂分子间的相互 作用，以揭示复合物的抗菌机理。结果表明，壳聚糖与两性、阴离子表面活性剂 之间发生静电作用，与非离子型表面活性剂之间形成氢键，复合物的结晶性发生 了变化，且易于热分解，这可能是由于复合物中壳聚糖的高级结构，如聚集态、 链构象等发生了变化，g p c 与特性枯数的测定结果也初步证实了这一点，这对 壳聚糖的抗菌性有着重要的意义。根据壳聚糖的抗菌机理，及其与表面活性剂的 相互作用，提出了复合物抗菌机理的模型，并由此找出复合物抗菌性的规律，即 一个具有疏水与亲水基团的小分子，只要其亲水基团能与壳聚糖氨基正离子形成 氢键、离子键等非共价键等，则该分子就能增强壳聚糖的抗菌性。 关键词：壳聚糖抗菌性抗菌机理表面活性剂复合物分子间相互作用 v a b s t r a c t c h i t o s a n ，ac o p o l y m e rc o n s i s t i n go f ( 1 ，4 ) - 2 一a c e t a m i d o 一2 一d e o x y - d - g l u c o s ea n db ( 1 , 4 ) 2 - a m i n o 2 - d e o x y d g l u c o s eu n i t s 。h a s a t t r a c t e dc o n s i d e r a b l ei n t e r e s t sd u et oi t s b i o l o g i c a l a c t i v i t i e ss u c ha s a n t i m i c r o b i a l ，a n t i t u m o r , i m m u n ee n h a n c i n ge f f e c t s ，a n d i t s n o n t o x i c i t y , d e g r a d a b i l i t y , r e n e w a b i l i t y a sa n t i m i c r o b i a la g e n t ，c h i t o s a na n di t sd e r i v a t i v e sc a n i n h i b i tt h eg r o w t ho f m a n yb a c t e r i aa n dn m 垂a tp r e s e n t ，s t u d i e sa b o u ta n t i m i c r o b i a la c t i v i t yo f c h i t n s a na n di t sd e r i v a t e s ，f a c t o r s ，t h et i n c t u r e a c t i v i t yr e l a t i o n s h i pa n di t sm e c h a n i s ma r en o tc l e a r t h er e s e n tp r o g r e s s e so nt h ea n t i m i c r o b i a la c t i v i t yo fc h i t o s a na n di t s d e r i v a t i v e s ，i t sf a c t o r s ， m e c h a n i s ma n d a p p l i c a t i o nw e r es u m m a r i z e d i nt h i s p a p e r t h ee f f e c t s o fs t r u c t u r eo nt h e a n t i m i c r o b i a la c t i v i t yo fc h i t o s a na n di t sd e r i v a t i v e s ，a sw e l la st h em e c h a n i s mo fa n t i m i c r o b i a l a c t i v i t y , w e r es y s t e m a t i c a l l ys t u d i e d a n d t h ea n t i m i c r o b i a la n ds u r f a c ea c t i v i t yo fc h i t o s a n c o m b i n e dw i t hs u r f a c t a n t s ，a sw e l l8 5t h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nc h i t o s a na n ds u r f a c t a n tm o l e c u l e ， w e r ea l s os t u d i e d ，s oa st od e t e r m i n ec o m p a t i b i l i t y s t r u c t u r e a n t i m i c r o b i a la c t i v i t y r e l a t i o n s h i p ， a n df i n do u tt h em e c h a n i s ma n dr e g u l a r i t yo ft h ei m p r o v e da n t i m i c r o b i a la c t i v i t yo fc h i t o s a nb y s u r f a c t e m t s t h ei l i a i nc o n t e n t sa n de o a e l u s i o n sa r es u m m a r i z e da sb e l o w ： 1 。u l t r a s o n i cd e g r a d a t i o no fc h i t o s a n ：2 8e h i t o s a ns a m p l e sw i t hd i f f e r e n tm w ( 9 8 3 10 4 - 9 1 10 4 ) a n dd d ( 9 2 - 5 5 ) w e r ep r e p a r e db y u l t r a s o n i cd e g r a d a t i o no f4 r a wc h i t o s a nm a t e r i a l sf m w ：1 5 4 x1 0 4 4 4 7x1 0 4 ，d d ：9 1 6 6 1 9 ) ，a n dt h e i rm w , d d c r y t a l l i r f i t i e sw e r ec h a r a c t e r i z e db yg p c ，u v ，i r ，x r d i ts h o w e dt h a tc h i t o s a n w i t hh i g h e rm wa n dl o w e rd ds h o w e df a s t e rd e g r a d a t i o n ；n em w p o l y d i s p e r s i t yo f t r e a t e dc h i t o s a n sw e r en a r r o w e r , t h eh i 曲e rt h em w o fr a wc h i t o s a n , t h en a r r o w e rt h e p o l y d i s p e r s i t yo f t h ed e g r a d e ds a m p l e s ；耵l ec r y s t a l l i n i t yo f u l t r a s o n i c t r e a t e dc h i t o s a n w a sh j g h e r ；u l t r a s o n i ct r e a t m e n td e c r e a s e dm ed d o fc h i t o s a n ，e s p e c i a l l yt h ed do f c h i t o s a nw i t hh i g h e rm w ( 1 5 4 x1 0 4 ) a n dl o w e r d d ( 7 2 1 ) d e c r e a s e dt o5 5 ，l 2 a n t i m i c r o b i a la c t i v i t yo fc h i t o s a na n di t sd e r i v a t i v e s ：n l em i n i m u mi n h i b i t i o n c o n c e n t r a t i o n ( m i c ) ，i n h i b i t i o nt i m e ( i t ) ，i n h i b i t i o nr a t ea n db i o c i d a le f f e c t ( w i t h i n 18 0m i n ) o fc h i t o s a na n di t sd e r i v a t i v e s ，a g a i n s tg r a m - p o s i t i v eb a c t e r i as u c ha ss a u r e u s , e p i d e r m i d i s ，g r a m n e g a t i v e b a c t e r i as u c ha sec o i lp a e r u g i n o s a n ，如n g ic a l b i c a n s w e r ed e t e r m i n e du s i n ga g a rp l a t ea n dl i q u i dm e d i u mm e t h o d s ，o 5 c h i t o s a nk i l l e d1 2l o gc f u m 1ec o l ii n5m i n ，a l le c o l ia n ds o m es t a p h y l o c o c c u s a u r e u si n1 2 0m i n a n di n h i b i t e dt h eg r o w t ho fec o l i ，p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a , s v l a u r e u s ，s t a p h l o c o c c u se p i d e r m i d i s ，b u tn o tc a n d i d aa l b i c a n s m i n i m u mi n h i b i t i o n c o n c e n t r a t i o n s ( m i c s ) a g a i n s tb a c t e r i aw e r ei nt h er a n g eo fo 0 2 5 0 0 5 ；t h e a n t i m i c r o b i a la c t i v i t yo fc h i t o s a ns a m p l e sg a i n e df r o m e n z y m eh y d r o l y s i sd e c r e a s e d w i t hd e c r e a s i n gm w , e s p e c i a l l yt h a tw i t hm w l o w e rt h a n1 0 0 0 0 ，w h o s em i c sc o u l d b elt i m e sl o w e r ；t h ea n t i m i c r o b i a la c t i v i t yo f c h i t o s a nt r e a t e d b y u l t r a s o n i c w i t h l o wm wa n dh i g hd d ，s h o w e ds t r o n g e s ti n h i b i t i o ne f f e c t ；a n t i m i c r o b i a l a c t i v i t yo f c h i t o s a nw i t hs i m i l a rd di n c r e a s e dw i t h d e c r e a s i n gm w ；b u t t h ea n t i m i c r o b i a l a c t i v i t y o fc h i t o s a nw i t hs i m i l a rm ww a sn o tb o u n dt oi n c r e a s ew i t hi n c r e a s i n gd d ，w h i c h w a sr e l a t e dt ot h em o l e c u l a rs t r u c t u r eo f s a m p l e s ；t h r o u g ha n a l y z i n g t h e a n t i m i c r o b i a la c t i v i t yo fc h i t o s a nd e r i v a t i v e s ，i ti sc o n s i d e r e dt h a tt h ea m i n o g r o u po f c h i t o s a ni sc r i t i c a lt oi t sa n t i m i c r o b i a la c t i v i t y , a n dt h em o d i f i c a t i o nt h a ti n c r e a s e st h e p o s i t i v ec h a r g eo fc h i t o s a nm o l e c u l eo rb e n e f i t st ot h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nc h i t o s a n a n d n e g a t i v ec h a r g e db a c t e r i a ls u r f a c ew i l li m p r o v ea n t i n f i c r o b i a la c t i v i t y , o rt h ec a s e i sc o n v e r s e t h ea n t i m i c r o b i a la c t i v i t yo fc h i t o s a na c e t a t es o l u t i o nc o m b i n e dw i t h o t h e ro r g a n i ca c i d ss u c ha sb e n z o i ca c i d ，s a l i c y l i ca c i d ，a s c o r b i ca c i da n dc i t r i ca c i d s o l u t i o n se x h i b i t e dl o n g e ri n h i b i t i o nt i m et h a nc h i t o s a na c e t a t es o l u t i o na l o n e a n d t h em i x e ds o l u t i o no fo 0 5 c h i t o s a na c e t a t ea n do 0 1 s a l i c y l i ca c i ds o l u t i o n s h o w e dt h eb e s ta n t i m i c r o b i a l a c t i v i t y b e t t e r a n t i m i e r o b i a l a c t i v i t y o fc h i t o s a n c o m b i n e dw i t ho r g a n i ca c i ds o l u t i o nw a sa t t a i n e dw h e nt h ep hw a sl o w e rt h a n5 8 3 i n t e r a c t i o nb e t w e e nc h i t o s a na n ds u r f a c t a n tm o l e c u l e s ：c o m p l e x e so fc h i t o s a n w i t h a m p h o t e r i c s u r f a c t a n ta l k y lb e t a i n ed e r i v a t i v e ( b e t a i n e ) ，n o n i o n i cs u r f a c t a u t a 1 1 ( ) r lp o l y g l y c o s i d e ( a o ) ，a n i o n i cs u r f a c t a n ts o d i u md o d e c y ls u l f o n a t e ( s d s ) a n d l i n e a ra l k y lb e n z e n es u l f o n a t e ( l a s ) ，w e r ep r e p a r e da n dc h a r a c t e r i z e db yr x r d ， t h e r m a la n a l y s i s ( t gd t g , d s c ) ，a n di t sg p c s p e c t r aa n ds p e c i f i cv i s c o s i t y ( h ) o fc o m p l e xs o l u t i o nw e r ei n v e s t i g a t e d , t h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nc h i t o s a na n d s u r f a c t a n sw e r ea n a l y z e d i ts h o w e dt h a ti ns o l u t i o n 淅l l lp h d e a e 壳聚糖 d e a e 甲壳素；k u r i t a 等【酬在甲壳素 与壳聚糖的c 6 位引入了d 甘露糖支链合成了带有a 甘露糖支链的甲壳素与壳 聚糖，并证明这种支链壳聚糖具有显著的抗菌性；酶壳聚糖的交联产物对大肠 杆菌也具有增强的杀菌活性吲。浓度为4m g m l ( p n5 4 - 6 8 ，3 t c ) 的n 羧甲基壳 聚糖3 ，6 二硫酸酯对体外培养的金黄色葡萄球菌、链球菌、奇异变形菌、大肠 杆菌等有抑制作用 8 6 3o 国内还有人报道了壳聚糖碘液的杀菌性【8 7 l ，羧甲基壳聚 糖银的抑菌活性 8 8 】等。 3 2 壳聚糖及其衍生物抗菌性的影响因素 壳聚糖及其衍生物的抗菌性受多种因素的影响，如m w 、d d 、浓度、溶剂、 介质p h 值、温度、衍生物的取代基种类、取代位置、取代度以及供试菌的种类 等等，因而在具体应用时应针对不同的用途、环境条件来合理选择不同规格的壳 聚糖及其衍生物，以达到最好的抑菌效果。 3 2 1 分子量的影响 很多资料表明，m w 是影响壳聚糖抗菌性的重要因素，但是报道的结果不甚 一致。